检测烟曲霉菌GM抗原生物素-亲和素-夹心酶联免疫吸附试验法的建立

本研究用重组烟曲霉半乳糖甘露聚糖 (ＡＦＭＰ1) ,制备免疫血清 ,建立一种以生物素 亲和素 (ＢＡ)系统为基础的夹心酶联免疫吸附试验 (ＥＬＩＳＡ)法 ,快速检测烟曲霉ＧＭ抗原[1] 。一、材料与方法1.动物和菌株来源 :家兔和豚鼠购自第一军医大学动物所 ,表达ＧＳＴ ＡＦＭＰ1融合蛋白ＢＬ2 1菌种及全部真菌标准株均由香港大学微生物系提供。2 .主要试剂 :ＧＳＴ融合蛋白纯化试剂盒、ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ 4Ｂ和ＥＣＬ底物显色剂 (ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ公司 ) ,弗氏佐剂 (Ｓｉｇｍａ产品 ) ,活化Ｓｕｌｆｏ ＮＨ…     

Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1(DV2-NS1)的血清型特异性单克隆抗体。方法以具有良好抗原性的重组DV2-NS1蛋白与灭活的Ⅱ型登革病毒(DV2)混合免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、IFA法筛选,ELISA、IFA及WesternBlot对mAbs的类型及亚类、交叉实验及特异性等进行鉴定。结果免疫的Balb/c小鼠经多次融合筛选,共获得14株血清型特异性抗DV2-NS1蛋白的mAbs,其亚类测定两株为IgG2b,余均为IgG1。ELISA和免疫印迹显示这些mAbs与重组DV2-NS1蛋白和DV2抗原均特异性结合,IFA结果显示这14株单抗特异结合Ⅱ型登革病毒,与其它3型登革病毒无交叉。结论成功获得了特异性针对DV2-NS1蛋白的mAb,为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及研制早期诊断试剂奠定基础。     

恒河猴自体静脉内皮细胞种植ePTFE人工血管后置换髂总动脉的实验研究

:15只恒河猴随机分为 2组 :实验组 10例 ,其人工血管均经自体静脉内皮细胞种植 ;对照组 5例 ,其人工血管均未经任何处理。实验组、对照组手术方法相同。将长 6cm、直径 3mmePTFE(膨体聚四氟乙烯 )人工血管近端与腹主动脉行端 -侧吻合、远端与髂总动脉行端 -端吻合。术后当日、1周及 4周 ,所有恒河猴均行静脉法数字减影造影术 ,术后 4周行彩色B型超声波检查 ,然后取出所有对照组及 9例实验组恒河猴腹腔内之人工血管 ,标本送光镜、扫描电镜及透射电镜检查。结果表明 ,术后 4周 ,对照组人工血管均不通畅 ,而实验组有 8条人工血管通畅良好。B超见全部对照组及 1例实验组人工血管腔内形成血栓 ,实验组 8条通畅之人工血管均保持较高的血流量。扫描电镜见实验组全部人工血管腔内均有一层完整融合的内皮细胞单层 ,而对照组人工血管腔内未见有内皮细胞。     

Ⅰ型登革病毒NS1抗原捕获ELISA的建立和初步临床诊断应用

目的以登革病毒特异性非结构蛋白1（NS1）单克隆抗体为基础建立Ⅰ型登革病毒（DEN1）抗原检测的酶联免疫吸附（ELISA）法，并探索从病人早期血清样品中检测DEN1-NS1的可行性。方法利用已制备的抗DEN1-NS1单克隆抗体（单抗），进行多种抗体组合配对优化模式的分析，建立双抗体夹心抗原捕获ELISA，以469份健康人血清样品确定cut off值，检测DEN1感染患者急性期血清样品。结果对多种抗体组合反复筛选，最终确立了最佳的包被单抗和酶标测定单抗，建立了抗体夹心捕获DEN1-NS1抗原的酶联免疫测定方法，能特异检测DEN1，与其他血清型登革病毒不发生交叉反应。检测16例临床确诊DEN1感染病人急性期血清样品，15例呈特异的抗原反应阳性。结论成功建立了DEN1-NS1抗原捕获ELISA并应用于临床血清样品的检测，为登革热的早期实验室诊断提供技术方法。     

体外扩增恒河猴自体内皮细胞人工血管移植研究（一）

目的:为恒河猴人工血管移植研究提供内皮化人工血管.方法;将恒河猴表浅静脉内皮细胞在体外培养13.89±1.36天;扩增培养的内皮细胞衬里于用纤维蛋白胶预衬的ePTEE人工血管,继续培养9天.结果:细胞数增加147.93±88.68倍.所培养的细胞为二倍体细胞,纯度99%.原代及传代细胞培养上清液中6-keto-PGFla和vWF含量无显著性差异.细胞种植后2小时和9天、人工血管腔面见一层均匀的基质,基质表面有一层连续的内皮细胞单层.内皮细胞紧密排列,呈梭状,形态饱满.细胞种植后9天,内皮细胞胞浆内微丝、微管数量明显增加,表明细胞骨骼成熟.结论:内皮化人工血管可用于置换恒河猴动脉.     

恒河猴血管内皮细胞原位获取的实验研究

应用原位获取法从５６条恒可猴中的５４条血管中获取了内皮细胞。、Ａ组用０．１％Ⅱ胶原酶消化２５ｍｉｎ，Ｂ组用０．１％Ⅱ型胶原酶消化１５ｍｉｎ。结果表明，Ａ组的内皮细胞获取率明显高于Ｂ组。Ａ组及Ｂ组中颈外静脉，上肢浅静脉、髂总动脉的内皮细胞获取率明显高于既往的机械获取法，灌注酶解消化法，外翻酶解消化法（Ｐ〈０．０１０，Ｂ组中下腔静脉及腹主 在消化过程中出现胶魇酶自血管壁渗出，使得内皮细胞获取率明显下降     

川芎嗪和阿斯匹林对组织培养中内皮细胞生长的影响

研究表明,川芎嗪、阿斯匹林能有效地提高PGI_2/TxA_2比值,从而提高内皮化人造血管的通畅率。本文旨在探讨这两种药物对内皮细胞生长的影响,对临床用药提供依据。 材料及方法 取成人大网膜10g,经D-Hank’s液清洗,0.8％胶原酶消化,淋巴细胞分离液分离出内皮细胞,加入含生长因子的1640-20培养基中,     

成人静脉内皮细胞单次传代大规模体外培养

用胶原酶消化成人静脉，总数：２５．９±６．７２×１０￣３个细胞。获取９．１２±４．３×１０￣３个细胞／ｃｍ￣２，活细胞率为９９％。以２．３９±０．４３×１０￣３个细胞／ｃｍ￣２的接种密度将其接种到一次性塑料培养皿中进行原代培养。待细胞进入增殖平台期后（生长时间为：７．２５±０．５ｄ），以１：２６比例将原代细胞进行传代培养。经８±０．８２ｄ培养后，细胞接触仰制形成。整个体外培养扩增时间为：１５±１．４ｄ，血管内皮细胞数增加了３３３±４０倍。经荧光标记第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体和透射电镜观察证实：１９９％以上的原代及传代细胞为血管内皮细胞。扩增后的血管内皮细胞染色体２ｎ＝４６条，未发现异倍体细胞。在原代和传代细胞的条件培养液内ｔ－ＰＡ和ＶＷＦ含量相差无统计学意义。     

曲霉抗原双抗体夹心ELISA法特异性检测

目的 用2组曲霉单克隆抗体(mAbs)建立特异性识别不同种类曲霉抗原的检测方法.方法 采用天然烟曲霉抗原免疫,获得广谱针对曲霉抗原的单克隆抗体;采用重组烟曲霉抗原获得特异性针对烟曲霉抗原的单克隆抗体,用间接免疫荧光鉴定,并分别建立2种双抗体夹心ELISA法,对19种常见的环境和临床分离曲霉株、马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液进行检测.结果 间接免疫荧光显示,用天然烟曲霉抗原免疫获得的单克隆抗体(mAbs-1)可广谱识别多种曲霉分离株,而重组烟曲霉抗原获得的单克降抗体(mAbS-2)仅能特异性结合临床和环境分离的烟曲霉抗原.用mAbs-1建立的双抗体夹心ELISA法可检测19种常见曲霉株培养液;用特异性针对烟曲霉抗原单克降抗体(mAbs-2)建立的双抗体夹心ELISA法可特异性检测临床和环境分离株烟曲霉培养液;与其他曲霉株无交叉反应;2种双抗体夹心ELISA法与马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液均无交叉反应.结论 2种曲霉单克降抗体双抗体夹心ELISA法,除可广谱检测环境和临床分离曲霉株,还可以区分烟曲霉与其他曲霉,可作为监测环境、农产品、食品中的曲霉污染和早期诊断曲霉病的新技术手段.