腺病毒介导gax基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,探讨gax基因表达增强后VSMC增殖的变化。方法　以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体 (AdCMV gax)常规转染VSMC后 ,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化 ;应用四唑盐 (MTT)比色试验、3H标记的胸腺嘧啶核苷 ( 3H TdR)掺入试验和流式细胞仪检测观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响。结果　①AdCMV gax转染前 ,PDGF BB下调Gax蛋白的表达 ,接近正常生理浓度的PDGF BB( 2ng ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由 3 6.42 %显著降低至 2 2 .83 %(P <0 .0 5 ) ,随着PDGF BB浓度的升高 ,gax基因表达下降程度更加显著 ;AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。②AdCMV gax转染使VSMC表达gax增强后 ,VSMC的MTT吸光度值和3H TdR掺入量均较未转染组显著降低 ,G0 G1期的VSMC比例较未转染组显著增高 (P <0 .0 1) ,G2 M期和S期细胞比例显著降低 (P <0 .0 1)。结论　增强gax基因表达可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC增殖     

p27基因对血管平滑肌细胞中连接蛋白43表达的影响

目的 研究连接蛋白43(Cx43)在p27基因抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中的作用.方法 以携带大鼠p27基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-p27)转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测p27和Cx43表达的变化;应用3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入试验观察p27基因表达增强对VSMC增殖的影响.结果 (1)Ad-CMV-p27转染前,血小板衍化生长因子BB(platelet.derived growth factor,PDGF-BB)下调P27蛋白的表达,AdCMV-p27转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中P27蛋白的表达均比转染前显著增高.(2)AdCMV-p27转染使VSMC中Cx43蛋白的表达基本恢复至有丝分裂原刺激前状态.(3)AdCMV-p27转染使VSMC的.H.TdR掺入量均较未转染组显著降低.结论 p27基因对Cx43表达的调控,使细胞间连接通讯得到维护,是其抑制VSMC增殖的重要机制之一.     

腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化.方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's小室观察gax基因表达增强对VSMC迁移的影响.结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调Gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2 ng/ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由36.42%显著降低至22.83%(P＜0.05),随着PDGF-BB浓度的升高,gax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC迁移数较未转染组显著减少.结论增强gax基因表达,可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移.     

腺病毒介导p27基因转染对离体血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨p27基因转染对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及其机制。方法通过构建携带p27基因的腺病毒并转染培养大鼠VSMC,增强其p27的表达,以免疫细胞化学方法检测p27蛋白在VSMC上的表达;并用3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入及流式细胞仪等方法检测p27过度表达,对有丝分裂原(血清和大鼠血小板衍化生长因子PDGF-BB)刺激VSMC增殖的影响以及细胞周期依赖性激酶2(CDK2)、细胞增殖核抗原(PCNA)和连接蛋白Cx43表达的变化。结果p27阳性表达率随AdCMV-p27转染VSMC时间延长而不断增加,24h达到峰值(85.81%)。AdCMV-p27转染可显著抑制有丝分裂原刺激引起的G0~G1期细胞减少和3H-TdR掺入量的增加(P<0.05);可抑制PDGF-BB刺激引起的CDK2、PCNA和Cx43蛋白表达阳性率的升高(P<0.05);并使p27蛋白表达阳性率由PDGF-BB刺激后的4.23%上升至33.91%(P<0.01)。结论p27过度表达可抑制有丝分裂原刺激引起的VSMC增殖,其机制与其增强p27表达及抑制CDK2、PCNA和连接蛋白Cx43表达有关。     

抑癌基因p27对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及DNA合成的影响

目的：探讨抑癌基因p27对增生性瘢痕的作用。方法：取体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞（HTsFb），将构建的pcDNA3-p27真核表达质粒体外转染HTsFb，经G418筛选获得稳定性表达的细胞克隆，用MTT和^3H-TdR掺入法观察抑癌基因p27对HTsFb增殖及DNA合成的影响。结果：抑癌基因p27对HTsFb增殖及DNA合成均有显著抑制作用。结论：抑癌基因p27可能通过抑制成纤维细胞增殖及DNA合成抑制瘢痕增生。     

热应激对培养血管内皮细胞增殖的影响

目的：探讨热应激条件下血管内皮细胞增殖变化的特点有相关机制。方法：以血管内皮细胞株MCV304受热43℃、2h为热应激实验模型，观察血管内皮细胞的细胞间粘附分子（ICAM－1）、分化抑制因子1（Id1)、P16及P21的蛋白表达变化，^3H标记胸腺嘧啶核苷酸（^3H-TdR)掺入法测定细胞DNA的合成。结果：热应激后血管内皮细胞ICAM－1表达增强，Id1表达受抑制，P16，P21蛋白的表达增强。^3H-TdR掺入实验显示热应激可显著抑制血管内皮细胞的DNA合成。结论：热应激可以活化血管内皮细胞，抑制细胞增殖，从而改变增殖与分化的协调关系，并可能进而影响创伤后组织细胞的修复。     

川芎嗪对PDGF-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和骨桥蛋白mRNA表达的影响

目的:探讨川芎嗪对血小板源生长因子(PDGF BB)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及骨桥蛋白mRNA表达的影响。方法:大鼠胸主动脉平滑肌细胞体外培养,PDGF BB刺激VSMC ,采用MTT法和流式细胞仪测定川芎嗪对VSMC增殖的影响,逆转录聚合酶联反应(RT PCR)测定VSMC骨桥蛋白mRNA的表达水平。结果:川芎嗪可显著地抑制VSMC增殖(P <0 .0 1) ,使细胞生长停滞于G0 /G1期;PDGF BB诱导骨桥蛋白mRNA呈高表达,川芎嗪下调了这种表达。结论:川芎嗪能抑制体外的VSMC增殖,提示川芎嗪可能作为防治血管成形术后再狭窄的一种药物。     

p53-p21通路在动脉血管平滑肌细胞衰老中的作用研究

[摘要]　目的　研究p53-p21通路在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）衰老中的作用。　方法　用血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）持续作用引起VSMC衰老,检测衰老相关蛋白分子的表达。利用β半乳糖苷酶（senescence associated beta galactosidase,SA-β-gal）染色确定VSMC衰老,检测经Ang II诱导的p53敲除小鼠及其同窝野生型小鼠VSMC的衰老情况,通过感染腺病毒p21及其对照GFP的方法使VSMC中p21过表达,用3H标记脱氧胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法检测p21过表达VSMC增殖,用流式细胞仪测定细胞周期。　结果　Ang II处理引起VSMC的p53、p21、p16表达增加,Ang II 处理后使p53基因敲除的VSMC衰老细胞数明显少于其对照p53野生型鼠的VSMC（P<0.01）,过表达p21显著抑制VSMC的3H-TdR掺入（P<0.01）,并且引起细胞周期G1期阻滞;过表达p21能引起VSMC衰老。　结论　p53-p21通路在Ang II引起的VSMC衰老发生过程中发挥重要作用。     

三七总皂苷对大鼠血管平滑肌细胞增殖模型细胞周期相关蛋白表达的影响

目的研究三七总皂苷(TPNS)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖细胞周期相关蛋白表达的影响。方法以血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导大鼠VSMC,观察含药血浆对VSMC增殖的影响,以免疫荧光流式细胞术测定增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期相关蛋白的表达。结果血小板衍生生长因子(PDGF)剌激VSMC后,VSMC PCNA、VSMC细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)蛋白表达增强,细胞周期抑制因子P21蛋白表达下调。阿托伐他汀含药血浆和TPNS含药血浆均可抑制PDGF诱导的VSMC PCNA、cyclinD1和CDK4蛋白表达增强及P21蛋白表达下调。TPNS与阿托伐他汀比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PDGF剌激VSMC后,可促进细胞周期转化,细胞增殖加快。阿托伐他汀、TPNS可抑制PDGF诱导的VSMC增殖,其作用可能是通过抑制了细胞周期相关调节蛋白的表达,从而抑制了VSMC细胞周期转化和增殖。     

骨形态发生蛋白-7基因转染骨髓基质细胞后的表达

为了观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）后的表达及表达产物对BM-SCs增殖的影响，用脂质体介导法将rhBMP-7基因转染BMSCs，用逆转录PCR技术和免疫组化SABC法分别检测其瞬时表达和稳定表达；再用^3H-TdR掺入法检测基因表达产物对正常培养的BMSCs增殖的影响。结果表明：转基因细胞能高效表达外源基因，且表达时间长达4周；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖。该结果为基因增强的组织工程技术用于关节软骨缺损的修复提供了理论依据。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因研究

目的 分析金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因与耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药的相关性。方法 采用琼脂二倍稀释法测定246株铜绿假单胞菌对14种抗菌药物的敏感性,Etest法进行金属酶表型的筛选,PCR检测金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因。结果 检出102株多重耐药株,21株广泛耐药株,分别占41.5%和8.5%;亚胺培南耐药组筛选出金属酶表型阳性24株,阳性率为37.5%,敏感组未检出;亚胺培南耐药组经PCR扩增金属酶阳性21株,阳性率为32.8%,其中8株为IPM-1,9株为IPM-2,4株为NDM-1,未检出VIM-1、VIM-2;敏感组株未检出金属酶基因,两组的检出率差异具有统计学意义(P<0.05);21株金属酶阳性和表型结果一致;耐药组耐消毒剂基因qacE?1阳性率为81.25%,敏感组阳性率为75%,两组间的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 耐亚胺培南铜绿假单胞菌表现为多重耐药;金属β-内酰胺酶基因的存在和其产生的金属酶是本地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一,其基因型主要为IPM-1、IPM-2和NDM-1,铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药还存在其他的主要机制;NDM-1阳性铜绿假单胞菌对头孢类抗生素、呋喃妥因、碳青霉烯类等多种抗菌药物耐药;合理使用有效的消毒剂将有利于控制NDM-1阳性菌的传播。     

基因枪在肿瘤基因治疗中的应用价值

目的 研究基因枪经小鼠皮肤转移基因的效率、被转基因的表达量、表达时间,以及对小鼠肿瘤的治疗效果,探讨作为一种 基因转移工具,基因枪在基因治疗中应用的可能性。方法 （１）用荧光显微镜观察基因枪对体外培养细胞系的基因转导效率和被转基因表达时间;（２）通过基因枪向小鼠皮肤转Ｌａｃ￣Ｚ基因后,取转瓣皮肤做冰浇灌发片进行β－ｇａｌ染色,观察转基因蛋白在皮人中表达的部位;（３）用ＥＬＩＳＡ法检测向小鼠皮肤转ｍ     

ApoE、A2M、ACE基因与汉人Alzheimer病的相关性研究

目的 探讨山西汉族人群载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)基因、a2-巨球蛋白(alpha-2 macroglobulin,A2M)基因、血管紧张素转换酶(angiotensin convening enzyme,ACE)基因多态性与Alzheimer病(AD)的相关性.方法 采用聚合酶链反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和电泳技术,观察山西汉族群体114例(AD患者55例,正常对照59例)的apoE基因、A2M基因、ACE基因多态性的分布并进行关联性分析.结果 AD组和对照组之间apoE各基因型分布总体比较其差异有统计学意义(P<0.05),其中ε4等位基因两组间比较存在明显统计学差异(P=0.000 2),且OR值大于5;AD组和对照组A2M各基因型、等位基因分布总体比较其差异有统计学意义(P<0.05).其中Ⅰ/Ⅴ基因型和Ⅴ等位基因与AD均呈显著正相关(Ⅰ/Ⅴ,基因型OR=2.85,95%CI=1.14-7.14;V等位基因OR=2.49,95%CI=1.05-5.89);两组间ACE各基因型及等位基因间的差异均无统计学意义(P>0.05).且按年龄、血压分层后AD组和对照组中ACE基因型及等位基因的分布差异无统计学意义;按是否携有apoE ε4分层后AD组和对照组A2M、ACE各基因型及等位基因两组分布均无差异(P>0.05).结论 apoE、A2M基因是晚发性AD的危险因子;AcE基因与晚发性AD不存在关联,还不能认为是晚发性AD的危险因子;且A2M基因、ACE基因与apoE基因无相互作用.     

携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体的构建

目的构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础。方法将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his。其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度。结果所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功。测定病毒50%组织培养感染剂量(TCID50)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml。结论成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准。     

卡介苗ERP基因置换型打靶载体的构建

目的：构建ERP基因打靶载体。方法：卡介前菌体外培养,扩增ERP基因两侧序列．连接载体与目的片段．筛选阳性克降并鉴定。结果：PCR扩增捕入片段大小与预期相符．鉴定证实PCR产物及插入片段为所需目的基因片段。结论：成功构建了用于卡介苗菌基因打靶的置换型载体,为今后构建ERP基因敲除株的卡介苗突变株的研究奠定基础。     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

核素报告基因显像在基因治疗监测中的应用

基因治疗作为一种新的疾病治疗方法,展示了广阔的临床应用前景;但基因治疗中仍存在着许多亟待解决的问题,尤其是如何实现在活体条件下对治疗基因的定位及表达进行监测和评估.放射性核素报告基因显像是近年来发展迅速的一种无创、灵敏的活体内监测基因表达的方法,具有灵敏度高和特异性强的优点,并可进行深部组织显像和重复显像,展示了良好的应用前景.文章就放射性核素报告基因显像用于监测基因治疗的原理、特点及应用进行综述.     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

无毛基因及其突变后引起的免疫学改变

无毛小鼠(hairless mice)是一种皮肤毛发结构表型性状发生遗传突变的小鼠,表现为被毛缺失或逐渐消失,包括有不同基因突变引起的多种类型,最早于1924年在伦敦的一家饲养场中偶然发现,当时认为是由野生型的Musmusculus突变所致。无毛小鼠不同于课鼠(nude mice,指一种先天性无胸腺无毛的裸体     

乳腺癌组织中PTTG与PTEN的检测及临床病理意义

[摘要]目的：研究乳腺癌组织垂体肿瘤转移基因（PTTG）和磷酸醋酶活性抑癌基因(PTEN)的表达及其意义。方法：采用原位杂交等技术检测乳腺癌组织小PTTG和PTEN结果：乳腺癌中PTTG的表达明显增高，而PTEN表达明显下降。PTTG高表达与淋巴结转移和病理分级密切相关；PTEN低表达与胸肌浸润、病理分级以及病理类型密切相关。PTTG与PTEN的表达无相关性。结论：PTTG高表达、PTEN低表达提示它们参与了乳腺癌的形成和发生，检测PTTG和PTEN的表达情况对乳腺癌的预防、术后辅助治疗和预后有重要参号价值。