HIV-I编码病毒蛋白R基因在真核细胞中的表达及其表达蛋白对KSHV溶解性周期复制的影响

目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码病毒蛋白R(Vpr)基因的重组真核表达质粒并初步探索Vpr基因编码蛋白对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响.方法:构建pVpr-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pVpr-Flag重组质粒临时转染BCBL-1和NIH3T3细胞,采用RT-PCR、IFA和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Vpr基因的表达情况:提取临时转染pVpr-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测KSHV次要衣壳蛋白编码基因ORF26(仅在病毒裂解期表达)mRNA转录水平,初步探索HIV-1 Vpr基因编码蛋白对KSHV复制的影响.结果:克隆的Vpr基因序列与GenBank中已登记的Vpr序列100%同源.RT-PCR、IFA和Western blot结果显示Vpr基因mRNA及其编码蛋白在真核细胞中得到了转录和表达.RT-PCR结果进一步显示,Vpr基因编码蛋白能够降低KSHVORF26mRNA转录水平.结论:成功构建含Vpr基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达:初步探索表明Vpr蛋白能够抑制KSHV溶解性周期复制.     

人类免疫缺陷病毒-1 Rev蛋白调控卡波济肉瘤相关疱疹病毒的裂解性周期复制与潜伏感染

目的:研究人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Rev蛋白的表达水平对原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解性周期复制与潜伏的影响?方法:自表达质粒pCI-neo-Rev中扩增出Rev基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中构建成慢病毒载体pLenti-Rev,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞?荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(IZsGreen)表达;收集培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得病毒悬液?梯度稀释法测定病毒滴度并感染细胞,RT-PCR和Western blot检测Rev在293T细胞中的表达?用慢病毒感染BCBL-1细胞,同时将表达质粒pCI-neo-Rev转染该细胞,采用Western blot分别检测Rev以及KSHV Rta和vIL-6蛋白的表达;Real-time PCR进一步从mRNA水平上定量验证Rev对KSHV复制的影响?结果:限制性内切酶酶切反应和基因测序证实成功构建了携带Rev基因的慢病毒表达载体,病毒滴度为2×107 TU/ml?重组慢病毒感染BCBL-1细胞72 h后,能够检测到Rev蛋白的表达?Western blot结果显示,低水平表达的Rev能够上调KSHV裂解期蛋白Rta?vIL-6的表达,而高水平表达的Rev则能够抑制Rta和vIL-6的表达?Real-time PCR进一步验证了该结果,表明高水平表达的Rev能够显著抑制BCBL-1中Rta的mRNA转录,96 h尤为明显?结论:成功构建了含Rev基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达Rev蛋白?Rev蛋白的表达水平对KSHV的复制与潜伏可能起到复杂的调控作用?     

人类免疫缺陷病毒１型病毒复制负调控因子编码基因的克隆及在ＢＣＢＬ-１细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的表达

目的:分离克隆人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的病毒复制负调控因子(Nagative factor,Nef)基因,并将其导入BCBL-I细胞和NIH/3T3细胞中进行表达.方法:根据GenBank登记的Nef基因核苷酸序列设计PCR引物,在其5'端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点;以含有Nef基因的pCINL质粒为模板,扩增Nef基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pCI-neo中.为了便于蛋白检测,在下游引物5'端引入Flag序列,构建重组真核表达质粒.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后分别瞬时转染BCBL-I细胞和NIH/3T3细胞,用RT-PCR、Western blot分别从核酸和蛋白水平检测Nef基因的表达情况.结果:成功构建了含Nef基因的重组真核表达质粒,核酸序列分析显示,克隆的Nef基因序列全长651 bp,与GenBank中登记的Nef基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Western blot都在Nef预期位置检测到特异性条带.结论:HIV-1 Nef基因在BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中获得了正确表达.     

人类疱疹病毒8型K8.1基因真核表达载体的构建与表达

目的构建和表达人类疱疹病毒8型(HHV-8)K8.1基因真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从HHV-8感染细胞BCBL-1细胞总DNA中扩增HHV-8 K8.1全长基因;克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+);将重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体转染人胚肾细胞293细胞,提取总RNA,反转录PCR(RT-PCR)检测重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体在293细胞中的mRNA。结果经测序,克隆的K8.1基因序列与GenBank中登记的K8.1基因100%同源;RT-PCR法检测在约370 bp位置出现条带,与预期的369 bp大小一致。结论 HHV-8 K8.1基因真核表达载体构建成功,并可在293细胞中表达。     

人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆?表达及表达产物的纯化

目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达.并纯化融合表达的vIL-6.方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和peD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基冈片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8 ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6伞长基因的重组原核表达质粒pvIL-6.重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.用glutathione Sepharese 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况.结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源:IPTG诱导后的菌体.经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生.Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带.结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8 ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化vIL-6融合蛋白.     

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1( )中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。     

HHV-8 K13基因编码蛋白在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖影响的初探

目的:研究人类疱疹病毒8型(HHV-8)K13(v-FLIP)基因编码蛋白分别在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达及其对上述两种细胞增殖能力的影响.方法:将PEF-K13-Flag-IRES/Pure重组质粒瞬时转染人血管内皮细胞系EA.HY926细胞和前列腺癌细胞系PC-3细胞,采用Western blot方法检测...     

Construction of Eukaryotic Expression Vector Containing K8.1 Gene from Human Herpesvirus 8 and Its Expression in Eukaryotic Cell

目的 构建和表达人类疱疹病毒8型(HHV-8)K8.1基因真核表达载体.方法 聚合酶链反应(PCR)法从HHV-8感染细胞BCBL-1细胞总DNA中扩增HHV-8 K8.1全长基因;克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+);将重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体转染人胚肾细胞293细胞,提取总RNA,反转录PCR(RT-PCR)检测重组K8.1+pcDNA3.1真核表达载体在293细胞中的mRNA.结果 经测序,克隆的K8.1基因序列与GenBank中登记的K8.1基因100%同源;RT-PCR法检测在约370 bp位置出现条带,与预期的369 bp大小一致.结论 HHV-8 K8.1基因真核表达载体构建成功,并可在293细胞中表达.     

含HIV-1 Vif基因重组慢病毒表达载体的构建及其对KSHV裂解性周期复制影响的初探

目的:利用慢病毒表达载体将HIV-1Vif基因导入原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中使之持续表达目的蛋白Vif,并检测Vif对其中潜伏KSHV裂解性周期复制的影响。方法:自表达质粒pCI-neo-Vif中扩增出Vif基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒载体pHAGE-Vif,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;收集培养上清经0.45μm滤器过滤后即获得病毒悬液。梯度稀释法测定病毒滴度,感染293T细胞,48h或72h后进行RT-PCR和Western blot检测Vif基因的转录和表达情况。以MOI为1.0的病毒量感染靶细胞BCBL-1,利用Westernblot技术检测Vif蛋白的表达,同时检测KSHVvIL-6和Rta的蛋白表达水平,初步探讨Vif对KSHV复制的影响。结果:限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带Vif基因的慢病毒表达载体,滴度为4×107efu/ml。以MOI为1.0的重组慢病毒感染靶细胞BCBL-172h后,能够检测到外源基因Vif的...     

人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达

目的：分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因K12，克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法：设计一对引物，在引物的5’端分别引入。BamH1、EcoRI酶切位点，以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV～8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVLl393中，构建成重组K12杆状病毒转移载体pVL-K12，并与线性：BaculoGold病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平；间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果：含HHV-K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达，经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论：杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。     

HIV-1感染相关细胞因子激活BC-3细胞中潜伏感染的人类疱疹病毒8型的复制研究

目的:研究证实HIV-1感染相关细胞因子能够诱导原发性渗出性淋巴瘤(PEL)的另一细胞系BC-3中潜伏的人类疱疹病毒8型(HHV-8)发生可溶性周期复制。方法:将TNF-α和HIV-1感染CD4~+ T淋巴细胞常释放的细胞因子IFN-γ、HGF/SF、OSM,连续加入到BC-3细胞中作持续刺激,分别于刺激后的第3天和第7天收集BC-3细胞。采用免疫组化染色法(IHC)检测HHV-8免疫原性蛋白ORF59表达;电子显微镜观察病毒的形成;Northernblot和 定量PCR检查次要衣壳蛋白ORF26 mRNA转录。结果:IFN-γ、HGF/SF、OSM和TNF-α均能不同程度上调ORF26 mRNA表达。其中,IFN-γ刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达上升了6.1倍;ORF59蛋白表达上升到20％,与此同时,BC-3细胞中可观察到成熟的病毒粒子。另外,TNF-α刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达也上升了2.5。结论:TNF-α和HIV-1感染释放细胞因子能够诱导PEL另一细胞系BC-3中潜伏的HHV-8发生可溶性周期复制。     

肝癌中高表达的新基因LAPTM4B对细胞增殖及成瘤性的影响

目的：研究在肝细胞癌中高表达的新基因LAPTM4B对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响，探讨LAPTM4B基因的生物学功能。方法：构建真核表达质粒pcDNA3-TM4B，利用脂质体稳定转染LAPTM4B cDNA至NIH3T3细胞中，用RT～PCR、Northem和Western杂交法筛选和鉴定转染后LAPTM4B基因高表达的单克隆细胞株，研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果：与转染空载体的对照组相比，转染了LAPTM4B cDNA的NIH3T3细胞表面发生明显变化，微绒毛的数量和长度增加，多分枝且缠绕成团。转染细胞在纤黏连蛋白、人工基膜和层黏连蛋白基质上的黏附／铺展能力增强。生长曲线显示转染细胞的生长速率增高。流式细胞仪检测显示转染细胞的S期细胞数比未转染细胞显著增多，而G0-G1期细胞数减少。Western杂交显示Cyclin E蛋白在转染细胞中的表达显著增加。转染细胞对血清的依赖性下降并具有成瘤性。结论：LAPTM4B基因能影响细胞增殖的调节，促进NIH3T3细胞的增殖，并使NIH3T3细胞具有成瘤性，在肿瘤发生过程中具有重要的作用。     

雷帕霉素对mTOR基因诱导的NIH3T3成纤维细胞增殖的影响

目的探讨雷帕霉素对mTOR基因诱导的NI H3T3成纤维细胞增殖的影响。方法以mTOR基因转染小鼠NI H3T3成纤维细胞,以雷帕霉素干预,用MTT法检测细胞增殖情况,用RT-PCR和Western blot方法测定细胞p70S6KmRNA与蛋白的表达。结果 MTT法检测转染mTOR基因后细胞增殖能力增强,雷帕霉素可抑制其增殖;RT-PCR与Western blot检测转染后细胞p70S6K的mRNA与蛋白表达水平明显增加,雷帕霉素可抑制p70S6KmRNA与蛋白表达水平。结论雷帕霉素可能通过抑制mTOR/p70S6K信号通路抑制成纤维细胞增殖。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

HHV-8 ORF50启动子区序列分离、鉴定及在293细胞中启动活性分析

目的：分离和鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF、50基因上游启动子区序列，评价其在293细胞中启动活性。方法：以佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV-8 ORE50启动子区序列，克隆进pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因上游多克隆位点，分别构建含正反双向ORE50启动子重组报告质粒，并分别转染293细胞，作Lu-ciferase活性检测，计算相对Luciferase活性单位(RLU)。结果：①克隆的HHV-8 ORF50启动子区序列长655碱基(bp)，含多个潜在推测AP1、SP1和ERE等转录因子结合序列；②ORF50启动子与正常pGL-3基本载体相比，其RLU增加了26．3倍；③TPA刺激后ORF50启动子与刺激前相比启动活性增加了4．1倍。结论：HHV-8 ORF50启动子区序列在293细胞中具有较强的启动活性；TPA可以作为一有效的阳性对照刺激物用于进一步鉴定ORF50启动子特性。     

人精子顶体膜相关蛋白32真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:研究人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)mRNA在体外细胞NIH3T3中的表达。方法:利用RTPCR及亚克隆技术构建pcDNA3.1( )hSAMP32质粒,实验组以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )hSAMP32真核表达载体导入NIH3T3细胞中,同时设置空白和阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1( ))。原位杂交检测hSAMP32mRNA在3组细胞中的表达。结果:①RTPCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致。亚克隆酶切鉴定可见目的片段。②实验组阳性细胞胞浆中可见hSAMP32mRNA的表达,镜下可见蓝紫色阳性颗粒,空白和阴性对照组未见蓝紫色阳性颗粒。结论:脂质体介导基因转染法能够将pcDNA3.1hSAMP32真核表达载体高效导入NIH3T3细胞中,实现了hSAMP32基因的体外表达。     

脂质体法pcDNA3-ELAC2质粒转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231以及前列腺癌细胞Du-145

目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞,用RT-PCR和WesternBlot分别检测ELAC2基因在细胞中的mRNA表达和蛋白表达。结果:pcDNA3-ELAC2质粒构建成功并顺利导入乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中,且检测到ELAC2基因的mRNA和蛋白高表达。结论:构建的pcDNA3-ELAC2重组质粒能够在转染的乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中稳定、持续和高效地表达,为进一步研究ELAC2基因的生物学功能提供了理想的实验模型。     

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.