含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白编码基因K8.1的分离、克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8．1编码基因，并置于大肠杆菌中作融合表达。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点，以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增出K8．1编码基因，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含K8．1基因重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞，以异丙基硫代-β—D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：分离、克隆的411bp序列与基因数据库中所登记的HHV-8 K8．1序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个41ku的融合表达蛋白产生。结论：HHV-8K8．1编码基因在E.coli中初步获得正确表达。     

人疱疹病毒6型101K被膜蛋白主要抗原决定簇区原核表达克隆的构建和表达

目的构建人疱疹病毒6型(HHV-6)101K被膜蛋白的原核高效表达克隆,并进行原核表达。方法PCR扩增HHV-6B 101K被膜蛋白的主要抗原决定簇区(666~834aa)编码基因片段(nt2 347~2 853),并导入T载体进行测序,与GenBank中HHV-6标准毒株序列比较以进一步鉴定。目的基因及表达载体pThioHis A分别经双酶切后连接,转化宿主菌E.coli BL21,应用PCR法及限制性核酸内切酶双重鉴定原核表达质粒,并经测序证实。IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白。结果PCR获得的目的基因序列与GenBank中HHV-6B标准毒株Z29序列一致,重组质粒诱导菌表达产物出现相对分子质量为31 900的融合蛋白条带。结论HHV-6 101K蛋白的原核表达克隆构建和表达成功,为进一步完善HHV-6活动性感染的血清学诊断提供了实验基础。     

沙眼衣原体pORF8质粒蛋白克隆表达与定位

目的克隆表达沙眼衣原体pORF8质粒蛋白,并在衣原体感染细胞中对其进行定位分析。方法 PCR法扩增pORF8基因,并将其定向插入pGEX-6p载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF8,重组体转化E.coli XL1Blue后经IPTG诱导表达pORF8融合蛋白,融合蛋白经Glutathione Sepharose亲和层析纯化后免疫Balb/C鼠,制备pORF8多克隆抗体;应用免疫荧光试验对pORF8质粒蛋白进行定位。结果 pORF8基因全长为744 bp,编码247个氨基酸残基,pGEX-6p/pORF8在大肠杆菌中表达相对分子质量约为54 000的GST-pORF8融合蛋白,间接免疫荧光实验结果显示pORF8在感染细胞中的表达模式与主要外膜蛋白基本一致,而与衣原体蛋白酶样活性因子分布模式不同。结论 pORF8质粒蛋白定位于衣原体菌体上,为衣原体菌体蛋白。该研究为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制奠定了基础。     

乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒，获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析．方法：PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因，双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a，转化E．coli DH5α，酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序；然后转化E．coli B121，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白组成；可溶性分析后用Ni^2＋ -NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白，Westem Blot分析特异性和抗原性．结果：成功构建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28a—Ct—preS1，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni^2＋ -NTA纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性．结论：HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化，为研究新型乙肝疫苗奠定了基础．     

人类8型疱疹病毒小衣壳蛋白ORF65基因的原核表达及其生物信息学分析

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）小衣壳蛋白（ORF65）基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法：软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌（E.coli）DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21（DE3）,并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析。结果：测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点。BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白。结论：成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员。     

C/EBPα不同截短功能域GST融合蛋白表达载体的构建及表达的研究

目的 构建GST-C/EBPa融合蛋白表达载体,并在大肠埃希茵(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1-C/EBPa为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并转化E-coliDH5α筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并用SDS-PAGE方法证实了GST-C/EBPa全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论 成功构建了C/EBPa原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化C/EBPa蛋白和研究C/EBPa的生物学功能奠定了基础.     

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的 构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435 bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达.结论 成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达.     

IL—6、IL—8与分娩发动的关系

目的　探讨白细胞介素 -6 (IL -6 )、白细胞介素 -8(IL -8)在分娩发动中的作用。　方法　随机选择孕 38～ 4 1周胎膜完整的单胎初产妇 1 5 0例 (临产前 90例 ,临产后 6 0例 )作IL -6、IL -8水平测定 ,进行对比分析。　结果　临产前血清IL -6处于低水平 ,临产后 ,血清IL -6水平升高 ,临床产前组与临床产后潜伏期 ( 30例 )和活跃期组 ( 30例 )差异显著 (F =1 5 87.6 7,P <0 .0 1 ) ;IL -8水平与宫颈Bishop评分呈直线正相关 (r =0 .883,t=1 7.6 4 8,P <0 .0 0 1 ) ,临产后组血清IL -8水平下降 ,临产前组与临产后潜伏期组、活跃期组间的差异显著 (F =2 0 7.6 8,P <0 .0 1 )。　结论　IL -6与子宫收缩相关 ,可能参与了分娩维持 ;IL -8与子宫颈成熟相关 ,可能参与了分娩发动。     

MMP-8、IL-6、IL-8水平与早产、胎膜早破关系的研究

目的 探讨基质金属蛋白酶-8(MMP-8)、细胞因子IL-6、IL-8与早产、胎膜早破的关系.方法 选择单胎初产妇100例作为研究对象,按孕周、胎膜是否破裂和产妇是否临产分为早产临产(PL)、未足月胎膜早破(PPROM)、足月胎膜早破(TPROM)、足月临产(TL)、足月未临产产妇组(对照组),共5组,每组各20例.用ELISA法检测孕妇羊水及血清中MMP-8及IL-6、IL-8的水平.用免疫组化法(SP)检测所有产妇子宫下段近宫颈处胎膜组织MMP-8的表达情况.结果 (1)PL、PPROM、TPROM、TL组羊水MMP-8水平分别为(465.71±78.02)ng/ml、(474.12±65.08)ng/ml、(262.81±43.56)ng/ml、(203.46 4±46.94)ng/ml,均高于对照组(121.57±37.38)ng/ml(均P<0.05),PL、PPROM组高于TPROM、TL组(均P<0.05),各组血清MMP-8水平差异无统计学意义(P>0.05);(2)PL、PPROM、TPROM组血清和羊水中IL-6、IL-8水平均高于TL组和对照组(均P<0.05),PPROM组高于TPROM、PL组(均P<0.05);(3)PL、PPROM、TPROM、TL组子宫下段近宫颈处胎膜组织MMP-8表达的免疫组化积分高于对照组(均P<0.05);(4)PL、PPROM、TPROM组合并绒毛膜羊膜炎患者羊水中MMP-8和IL-6、IL-8水平明显高于非绒毛膜羊膜炎患者(均P<0.05);(5)羊水中MMP-8水平与血清、羊水中IL-6、IL-8水平呈正相关(r=0.798、0.793.均P<0.05);羊水MMP-8水平与MMP-8在胎膜上的表达呈正相关(r=0.662 P<0.05).结论 (1)MMP-8、IL-6、IL-8与早产、胎膜早破密切相关;(2)羊水MMP-8和血清、羊水IL-6、IL-8的升高对诊断绒毛膜羊膜炎有临床应用价值,可作为早产、胎膜早破合并绒毛膜羊膜炎的诊断指标;(3)羊水中MMP-8、IL-6、IL-8的升高在早产、胎膜早破中起协同作用,细胞因子IL-6、IL-8通过诱导MMP的合成和活化,使羊水中MMP-8水平升高及胎膜MMP-8表达增加,导致早产、胎膜早破.     

角膜移植患者术前、术后IL-6、IL-8及T淋巴细胞亚群的测定

目的：探讨 Ｉ Ｌ ６、 Ｉ Ｌ ８ 与角膜移植的关系。方法：采集 １９ 例角膜移植患者术前 １ ｄ 及术后３～５ ｄ空腹静脉血,应用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法测定血清中 ｓ Ｉ Ｌ ６、ｓ Ｉ Ｌ ８ 水平,应用流式细胞仪测定 Ｔ 淋巴细胞亚群的变化。结果：患者术前ｓ Ｉ Ｌ ６、ｓ Ｉ Ｌ ８ 水平接近正常人,术后明显升高,而 Ｔ 淋巴细胞亚群的改变则无统计学意义。结论： Ｉ Ｌ ６、 Ｉ Ｌ ８ 作为细胞因子较早参与了角膜移植术后的免疫反应。     

窒息新生儿血清IL-6和IL-8水平变化及其临床意义

目的 探讨外周血白细胞分素-8(IL-8)在窒息新生儿中的变化及临床意义.方法 采用ELISA法检测42例不同程度窒息新生儿不同病期血清的IL-6、IL-8水平,并与正常足月新生儿脐血42例进行对照.结果 窒息新生儿第1天血清IL--6为57.6 ng/L(中位数,以下同),IL-8为353.3 ng/L,明显高于正常脐血对照组的2.0、92 ng/L(Z=4.564～5.856,P＜0.01).重度窒息组患儿血清IL--6、IL-8分别是87、579.6 ng/L,分别高于轻度组(52.6、336.3 ng/L)(Z=2.228～2.702,P＜0.05).血清IL-6、IL-8水平间呈显著正相关(α=0.59～0.72,P＜0.01).窒息组患儿动态观察发现,病程第3天时血清IL-6(56.6 ng/L)、IL-8(320.6 ng/L)水平较第1天时(分别为57.6、353.3 ng/L)差异均无显著性(Z=0.314～1.372,P＜0.05);第7天时血清IL-6(14.6 ng/L)、IL-8(238.4 ng/L)水平均明显低于第1天和第3天时(Z=2.455,P＜0.05,Z=3.622,P＜0.01).结论 窒息新生儿血清中IL-6、IL-8水平明显增高,在新生儿窒息发病机制中起重要作用.     

急性颅脑损伤患者血清IL-6、IL-8动态变化及临床意义

目的 探讨颅脑损伤急性期IL-6、IL-8的动态变化及其与颅脑损伤程度和病情变化的关系.方法 34例急性颅脑损伤患者依据格拉斯哥评分(GCS)、临床表现、影像资料分成两组(GCS≤8分组和GCS 9～12分组).动态测定伤后15 d内6个不同时间点血清IL-6、IL-8浓度,采用放射免疫分析法检测;数据分析用独立样本t检验、配对样本t检验、偏相关分析.结果 IL-6于GCS≤8分组第2天达到最高水平,GCS9～12分组第7天达到最高峰;两组总体比较P=0.046<0.05,差异有统计学意义.IL-8于CS≤8分组于第7天达到最高峰,GCS 9～12分组于第3天达到最高水平:两组总体比较P=0.045,差异有统计学意义.IL-6与IL-8两指标中,IL-6水平于第2天达到最高峰,IL-8水平于第7天时达到最高峰,且IL-6水平最高峰大于IL-8.IL-6与IL-8总体比较P=0.000,差异显著.结论 急性颅脑损伤患者血清IL-6、IL-8水平的变化反应了颅脑损伤患者病情严重程度.且与病情呈正相关,IL-6较IL-8的变化敏感,IL-6、IL-8水平经相关性分析相关关系不密切且无统计学意义.在临床意义上早期对颅脑损伤患者病情变化的判断血清IL-6较IL-8有明显的优势.     

急性特发性血小板减少性紫癜患儿血清IL-6和IL-8的变化

目的探讨急性特发性血小板减少性紫癜（ITP）患儿血清IL-6、IL-8的变化及意义。方法采用酶联免疫法检测45例急性ITP患儿血清IL-6和IL-8水平。结果ITP患儿急性出血期IL-6、IL-8水平明显高于正常参考值。结论IL-6、IL-8在儿童ITP的发病中可能起重要作用。     

实验性萎缩性胃炎大鼠细胞因子IL-6,IL-8的变化及意义

目的探讨热水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎形成过程中血清IL-6,IL-8含量的动态变化及意义。方法将实验动物按随机化原则分成3组,即正常喂养组、正常对照组和热水组。正常喂养组为正常喂养,自由饮25℃白开水;正常对照组为25℃白开水灌胃,每次2.5ml,1次/d;热水组为55℃水灌胃,每次2.5ml,1次/d。各组分别于4周、8周、12周、24周、32周各随机取4只,观察胃黏膜萎缩情况,并同时抽血分离血清,用ELISA方法检测血清IL-6,IL-8含量。结果热水组灌胃至24周时出现大鼠胃黏膜层变薄,固有层腺体减少,固有层纤维结缔组织增生,黏膜肌层明显增生,慢性炎细胞浸润等萎缩性胃炎表现,随着热水灌胃时间的延长,32周胃黏膜萎缩程度明显加重。正常喂养组和正常对照组大鼠各时间点血清IL-6,IL-8含量基本相同;热水组大鼠血清IL-6,IL-8含量在4周就明显升高,8周,12周时IL-6、IL-8含量仍保持在较高水平,与正常对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;24周萎缩性胃炎形成后,其含量与正常对照组相比,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论在热水刺激形成萎缩性胃炎的过程中,IL-6和IL-8的升高可能是热水损伤胃黏膜的主要机制之一,在萎缩性胃炎形成过程中起重要的先导作用。     

丹莪妇康煎膏对子宫内膜异位症大鼠血清IL-6和IL-8含量的影响

目的：探讨丹莪妇康煎膏对子宫内膜异位症（ EMS）大鼠血清中IL-6和IL-8含量的影响及治疗EMS的机制。方法：建立大鼠EMS模型,SD大鼠随机分为空白组、模型组和治疗组,每组10只,采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-6和IL-8含量。结果：与模型组相比,治疗组大鼠血清中IL-6和IL-8含量明显下调。结论：降低血清中IL-6和IL-8含量可能是丹莪妇康煎膏治疗子宫内膜异位症的机制之一。     

阴阳平衡散对溃疡性结肠炎患者血清细胞因子的影响

目的观察阴阳平衡散对溃疡性结肠炎（UC）患者血清IL-6、IL-8的调节作用并探讨其作用机制。方法68例UC患者随机分为A、B两组：A组35例，采用阴阳平衡散灌肠治疗；B组33例，采用柳氮磺胺吡啶肛栓剂治疗。采用双抗体夹心法ELISA法测定两组患者治疗前后和35例健康志愿者血清IL-6、IL-8的水平。结果A组显效率为88，6％（31／35），B组显效率为63．6％（21／33），两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。A组治疗后血清IL-6、IL-8水平与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05），但A组血清IL-8和B组治疗后血清IL-6、IL-8水平治疗后仍高于对照组（P〈0．01）。结论阴阳平衡散灌肠治疗UC有效，能够下调IL-6、IL-8的表达及生成，可能是其治疗UC的作用机制之一。     

卵巢恶性肿瘤组织中细胞因子IL-6、IL-8的研究

目的 通过测定细胞因子IL－6在卵巢癌中的表达、泰素诱导下体外培养卵巢癌细胞局部环境中细胞因子IL－8、IL－6的表达,以探求细胞因子IL－6、IL－8在卵巢上皮癌中的临床价值。方法 ①应用MTT比色测定法对30例卵巢癌患者血清、腹水中细胞因子IL－6进行生物活性测定;②应用ELISA方法定量测量5个卵巢癌细胞系及10例初代培养卵巢癌细胞局部环境中细胞因子IL－8在泰素作用后水平的变化。结果 ①腹水中IL－6水平明显高于血清中IL－6水平（P＜0．0001）;②腹水或血清中IL－6水平与卵巢癌分期呈正相关;③在5个卵巢癌细胞系中,泰素选择性诱导3个细胞系IL－8水平显著增高,IL－6水平无明显变化;在10例初代培养卵巢癌细胞中,5例IL－8水平显著增高。结论 ①腹水或血清中IL－6生物活性的测定有可能成为卵巢癌疾病状态的评估及选择化疗药物的根据;②泰素可以选择性诱导IL－8的释放,调节局部炎症反应和肿瘤组织的生长及转移。