胃癌组织和SGC-7901细胞中nucleostemin基因表达的实验研究

目的检测nucleostemin(NS)基因在胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞中的表达情况。方法21例胃癌手术标本,提取胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞株总RNA,用半定量RT-PCR方法检测胃癌组织和SGC-7901中NS基因的表达情况。用脂质体法将PCDNA4/C-NS-silencer质粒及空载体PCDNA4/C-vector质粒分别转染SGC-7901细胞,分别命名为silencer组和vector组,未转染的SGC-7901细胞记为normal组,RT-PCR方法检测NS基因表达量。用MTT法检测3组细胞的生长增殖情况。结果胃癌组织和SGC-7901细胞中皆有NS基因表达。定性分析显示,与vector组和normal组比较,silencer组细胞趋于分化,NS基因表达量下降。细胞培养24 h、48 h、72 h后,si-lencer组和vector组细胞增殖抑制率间差别均有统计学意义(P<0.01)。结论胃癌组织和SGC-7901细胞中有NS基因表达;NS基因特异性RNA干扰使NS基因表达量下降,抑制SGC-7901细胞株体外增殖。     

Ｌｉｖｉｎ特异性ｓｉＲＮＡ表达载体在胃癌细胞中的稳定表达

目的:构建以Livin基因为靶基因的siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo/Livin,获得稳定沉默Livin基因的胃癌细胞SGC-7901/siRNA-Livin.方法:化学合成siRNA,Livin寡核苷酸,将其分别克隆进载体pGPU6/GFP/Neo,进行核酸序列测定.脂质体法转染SGC-7901细胞,半定量RT-PCR和Western blot检测Livin基因在SGC-7901细胞中的沉默效率,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆.结果:酶切分析显示,所有质粒均为阳性重组载体,核酸测序表明合成的序列准确插入pGPU6/GFP/Neo载体,G418筛选基因转染SGC-7901细胞后形成稳定克隆.其中pGPU6/GFP/Neo/Livin-4转染后Livin mRNA沉默效率大于70%.结论:成功获得Livin特异性siRNA表达载体,SGC-7901细胞Livin基因的表达受到抑制,转染胃癌细胞后获得SGC-7901/siRNA-Livin细胞克隆.     

HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.     

NS特异性siRNA真核表达载体的构建

目的：构建nucleostemin(核干细胞因子，NS)特异性siRNA真核表达载体。方法：以小鼠组织基因组DNA为模板，PCR方法克隆小鼠编码U6 snRNA基因的启动于，将NS—siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动于连接起来，并将其插入pcDNA4／C载体中。结果：(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6 snRNA基因的启动子，(2)构建了含有U6启动子、NS—siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS—siRNA表达的片段，(3)将NS—siRNA表达片段插入了pcDNA4／C真核表达载体。结论：构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4／C—NS—Silencer。     

鸟苷酰环化酶C小干扰RNA对胃癌细胞生长的影响

目的：研究靶向鸟苷酰环化酶C（Guanylyl cyclaseC,GC-C）的小干扰RNA（siRNA）对人胃癌SGC-7901细胞体外生长能力的影响。方法：利用pSilencer TM4.1-CMVneo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA。将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光观察转染前后胃癌细胞GC-C基因的表达变化,黏附实验观察转染前后胃癌细胞黏附能力。结果：构建的GC-CsiRNA测序鉴定与设计完全相符。GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞后,明显抑制GC-C基因的表达。转染后,GC-CmRNA和蛋白表达分别抑制了66.7%和75.8%,细胞黏附能力较对照组减弱（P〈0.05）。结论：靶向GC-C的siRNA可明显下调靶基因GC-C的表达,在体外抑制胃癌SGC-7901细胞的黏附,提示GC-C基因与胃癌的发生、发展有密切的关系。     

蛋白激酶B siRNA转染胃癌SGC-7901细胞对其侵袭能力的影响

目的研究蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）小干扰RNA（siRNA）转染人胃癌SGC-7901细胞,探讨转染后抑制癌细胞转移侵袭的可行性．方法应用基因转染技术将蛋白激酶基因片段转染至胃癌SGC-7901细胞中,采用Millicell小室、集落形成实验、流式细胞术等方法观察蛋白激酶B siRNA转染后对转染组细胞侵袭力的影响．结果与对照组比较转染组的胃癌SGC-7901细胞克隆增殖速度和侵袭能力明显减弱（P〈0．01）,提示转染组siRNA能特异性抑制蛋白激酶B基因的活化,即蛋白激酶B基因的siRNA片断可抑制胃癌SGC-7901细胞的克隆增殖和癌细胞转移侵袭．结论应用RNAi使蛋白激酶B基因沉默能有效抑制人胃癌SGC-7901细胞的克隆生长,并在一定程度上阻止了癌细胞的侵袭和转移,其作用机理值得进一步的深入研究．     

GW112基因siRNA对人胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响

目的 构建靶向GW112 siRNA逆转录病毒载体并筛选特异高效的RNAi靶点,研究GW112基因沉默后对胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响.方法 应用逆转录病毒载体psilencer 5.1-H1 Retro 构建针对GW112基因3个不同靶点的RNAi干扰载体-pSiRNA-GW112 (pSi405-GW112, pSi1066-GW112, pSi1480-GW112),将脂质体法转染PT67细胞包装的病毒感染SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳定克隆,RT-PCR鉴定病毒整合,Real-time PCR筛选高效抑制靶点,CCK-8法检测对细胞体外增殖的影响.Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果 测序结果证实各干扰靶点的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112构建正确.RT-PCR结果显示除亲本细胞外,经各靶点病毒上清感染的细胞均能扩增出510 bp的Puro抗性基因片段.Real-Time PCR分析表明与SGC-7901亲本细胞组相比,7901-Si405,7901-Si1066及7901-Si1480组GW112的转录水平分别只有SGC-7901组的(15.50±0.01)%,(32.40±0.01)% 与(57.00±0.02)%.而7901-Sc组GW112表达基本无变化.Si405, Si1066与 Si1480 靶点的抑制率分别为84.5%,67.6%及43.0%.沉默GW112后导致SGC-7901细胞体外增殖能力显著抑制(P<0.05),并伴随PCNA蛋白表达下调.结论 构建的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112能显著抑制SGC-7901细胞的体外增殖能力,且这种增殖抑制与下调的PCNA表达有关.     

GW112基因逆转录病毒载体的构建及在胃癌SGC-7901细胞的表达研究

目的 构建人GW112基因的逆转录病毒载体,并通过病毒介导其在人胃癌SGC-7901细胞的稳定表达.方法 采用DNA 重组技术构建并鉴定重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-GW112;以脂质体PT67细胞包装病毒,经病毒感染的SGC-7901细胞通过G418筛选及荧光定量 PCR 鉴定,建立GW112稳定过表达SGC-7901细胞株.结果 成功构建了pLEGFP-N1-GW112逆转录病毒表达载体,经病毒包装的重组转录病毒成功感染SGC-7901细胞,Real-Time PCR结果显示实验组中GW112基因是对照组细胞中的4.2倍.结论 逆转录病毒介导的GW112基因在胃癌SGC-7901细胞获得了稳定过表达,为进一步研究GW112在胃癌中的功能奠定了良好基础.     

谷氨酰胺酶反义基因诱导胃癌细胞凋亡的作用研究

目的 利用反义核酸技术封闭胃癌细胞的谷氨酰胺酶基因,观察反义GAcDNA能否对胃癌细胞的恶性表型有所逆转,为肿瘤的基因治疗探索一条新途径,也为后续研究及临床应用奠定基础.方法 将含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA,通过脂质体介导转入胃癌细胞SGC-7901,经筛选、鉴定,命名为SGC-7901GA,采用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,观察反义核酸转染后胃癌细胞凋亡的改变.结果 pcDNA3.0/GA通过脂质体介导转染胃癌细胞SGC-7901,PCR证实GAcDNA目的 片段已经整合到了SGC-7901细胞基因组,获得的G418抗性细胞命名为SGC-7901GA.检测胃癌细胞的凋亡情况表明重组质粒转染后SGC-7901GA的TUNEL阳性细胞数量显著上升,与对照组比较差异有统计学意义.结论 本实验通过含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA转染胃癌细胞株,发现胃癌细胞的凋亡指数增加,提示肿瘤细胞恶性程度有所降低,反义核酸技术封闭谷氨酰胺酶基因可能成为肿瘤基因治疗的一条新途径.     

YKL-40基因真核表达载体的构建及对人胃癌SGC-7901细胞增殖作用的影响

目的:构建针对人类软骨糖蛋白-39(HCGP-39,YKL-40)的真核表达载体,观察其对肿瘤细胞增殖的影响.方法: 采用逆转录方法从乳腺癌组织中获得基因YKL-40,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,重组体经限制性内切酶及测序鉴定,将阳性克隆的载体转染胃癌细胞株SGC-7901,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性、细胞计数并观察细胞生长情况、半定量RT-PCR检测基因YKL-40 mRNA的表达、流式细胞术检测SGC-7901细胞的周期变化情况.结果: 限制性内切酶及测序鉴定表明成功地构建了针对基因YKL-40的真核表达载体;将其转染胃癌细胞SGC-7901后,发现细胞增殖加快,差异具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测基因YKL-40 mRNA的表达增加;流式细胞检测S期细胞增多.结论: 成功地构建了针对基因YKL-40的真核表达载体,该载体可使胃癌细胞株SGC-7901增殖加快.     

黄芪多糖与顺铂联合对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用的研究

目的：研究黄芪多糖和顺铂联合应用对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察黄芪多糖和顺铂对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用。结果：黄芪多糖能抑制人胃癌SGC-7901细胞株的增殖,并呈浓度及时间依赖性,黄芪多糖和顺铂联合应用应用对胃癌细胞的抑制作用显著高于单用黄芪多糖、顺铂组。结论：黄芪多糖在体外对胃癌细胞株SGC-7901细胞的增殖有明显的抑制作用,黄芪多糖和顺铂联合应用效果强于单独用药组。     

积雪草苷抗人胃癌细胞株SGC-7901作用的研究

目的:观察积雪草苷对人胃癌细胞株SGC-7901的作用;初步探讨积雪草作用于胃癌SGC-7901细胞的机制。方法:采用MTT法观察积雪草对胃癌细胞增值抑制的作用,流式细胞术检测积雪草苷对胃癌细胞凋亡的诱导作用,透射电镜观察SGC-7901凋亡细胞的超微结构。结果:积雪草苷作用的胃癌细胞增值被抑制;促进了胃癌细胞株SGC-7901的凋亡,并存在量效关系。透射电镜观察显示胞质浓缩,核固缩,并可见凋亡小体。结论:积雪草苷可抑制人胃癌细胞SGC-7901的增值并诱导其凋亡。     

反义hTR对人胃癌细胞株SGC-7901恶性表型的逆转作用

目的 探讨反义ｈＴＲ基因转染对胃癌细胞系ＳＧＣ－７００１恶性有型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法 构建包含端粒重复序列模板区的反义ｈＴＲ基因真核表达载体用脂质体法将其转染率胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１,比较观察反义ｈＴＲ基因转染后７９０１细胞的ｈＴＲＲＮＡ表达、端粒酶活性、体外生长增殖降低,体外生长增殖能力降低,接触抑制恢复、细胞凋亡率增加、软琼脂集落形成能力和裸鼠体内致瘤能力完全消失。结     

熊果酸对胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用

目的：本文通过不同浓度的熊果酸（ursolic acid,UA）作用于人胃癌SGC-7901细胞,探讨UA对其生长的影响。方法：采用体外培养人胃癌细胞株SGC-7901,MIT法观察不同浓度UA对细胞生长的影响;用10μmoL／L,20μmoL／L,40μmoL／L和80μmoL／L不同浓度UA处理SGC-7901细胞12h后,倒置显微镜观察细胞形态变化以及MTT检测细胞的生长情况。结果：在细胞抑制实验中20～40μmoL／L UA可使SGC-7901细胞发生皱缩,40—80μmoL／LuA作用12h后,SGC-7901细胞形态明显变圆,出现不同程度的漂浮;同时MTT实验结果表明,不同浓度的UA能抑制SGC-7901细胞的生长并呈浓度依赖性。结论：UA能够抑制SGC-7901细胞的生长,具有较强的抗肿瘤活性。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

黄芪多糖针对人胃癌细胞SGC-7901体外实验抑制作用

目的：体外研究不同浓度的黄芪多糖对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响。方法：体外培养人胃癌细胞SGC-7901,采用MTT比色法检测不同浓度（6ug/mL、12．5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL）的黄芪多糖提取液对其增殖的抑制作用,并用酶联检测仪在450nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。结果：在细胞抑制实验中,加药12h后,浓度高于25ug/mL的黄芪多糖均能表现出对人胃癌细胞SGC-7901的增殖的抑制作用,同时MTT实验结果表明,在药物浓度12．5ug/mL时,人胃癌细胞SGC-7901的增殖因药物浓度低,有上升趋势。随着黄芪多糖的药物浓度增加,在药物浓度50ug/mL～100ug/mL时有明显抑制人胃癌细胞SGC-7901生长的趋势,并呈浓度依赖性。结论：黄芪多糖在体外实验对人胃癌细胞SGC-7901的增值有较强的肿瘤抑制作用。     

重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6 基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用. 方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6. 将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞. MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用. 结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确. 转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达. MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征. 结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.     

人反义端粒酶RNA转染SGC-7901细胞后细胞周期调控基因表达的改变

目的：观察反义人端粒酶RNA(Human telomerase RNA components,hTR)转染的SGC－7901胃癌细胞（7901－ahTR)细胞周期调控基因表达的变化。方法 采用RT－PCR、Western印迹和免疫组化方法检测SGC－7901和7901－ahTR细胞p21、p27、p16、c-myc等基因mRNA和蛋白的表达。结果 反义hTR转染的7901细胞p21和p27表达增加,PCNA和c-myc表达下调,而cyclinD1和p16mRNA表达无明显变化。结论 抑制端粒酶活性能调节多种细胞周期调控基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖和诱导分化。     

组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠对胃癌细胞系生长及p16基因表达的影响

目的 探讨组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠(NaB)对体外培养的胃癌细胞系SGC7901和BGC823生长及p16基因表达的影响.方法 应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素染色法检测细胞凋亡率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测p16基因mRNA及蛋白质表达,甲基化特异性PCR法(MSP)检测p16基因的甲基化状态.结果 NaB处理后SGC7901和BGC823细胞生长受到抑制,1×10-3,3×10-3,5×10-3mol/L NaB处理72 h后两株细胞G0/G1期细胞数量显著增加,S期细胞数显著降低(P<0.01),呈现G1阻滞,各浓度组细胞凋亡率均显著增加(P<0.01).p16基因在SGC7901及BGC823细胞中低表达,启动子区呈异常甲基化状态,NaB处理后在两株细胞中表达均增强.结论 NaB对胃癌细胞具有生长抑制作用,其机制可能与阻滞细胞周期、诱导凋亡及上调p16基因表达有关,NaB可能通过增加组蛋白乙酰化水平及甲基化下调增加胃癌细胞中p16基因的表达.