胃癌癌前病变相关分子研究若干进展

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,胃黏膜上皮细胞癌变是一个渐进的过程,其主要癌前病变为胃黏膜上皮异型增生和肠上皮化生.近年来国内外学者在胃癌癌前病变的分子水平上,蛋白类、酶类、基因类等多种相关分子的表达研究取得了一定进展,筛选具有高度特异性、敏感性的标志物是今后研究的方向.     

微RNA-9对胃癌细胞内CDX2基因表达的影响

目的探讨改变胃癌细胞中微RNA-9(miRNA-9)的表达水平对尾型同源核转录因子2(CDX2)表达的影响。方法采用生物信息学预测调控CDX2的目的 miRNA。采用脂质体法将miRNA-9类似物、miRNA-9抑制物和无关序列质粒瞬时转染胃癌细胞株AGS、MKN45,以无关序列作为阴性对照。将细胞分为miRNA-9类似物组、miRNA-9抑制物组、阴性对照组、空白对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miRNA-9和CDX2mRNA的表达水平,采用免疫印迹实验(Western blot)检测CDX2蛋白表达。结果 CDX2mRNA 3′UTR和miRNA-9有高度保守的结合靶点。与空白对照组、阴性对照组相比,miRNA-9类似物组细胞中的CDX2蛋白表达显著降低,miRNA-9抑制物组的CDX2蛋白表达显著上调,而CDX2mRNA表达未发生显著变化。结论在胃癌细胞株AGS、MKN45中,miRNA-9具有抑制CDX2蛋白表达的作用,而对CDX2mRNA表达无影响。抑制miRNA-9表达后,CDX2蛋白表达明显上调。     

胃癌及癌前期病变粘膜芳香基酰胺酶同工酶的表达意义

目的探讨胃癌及癌前期病变粘膜芳香基酰胺酶（ＡＡＤ）同工酶的表达规律，寻找癌前期病变及早期癌的标志物．方法采用本室建立的圆盘等电聚焦电泳（ＣＩＥＦ）分离１２２例各种胃病粘膜（胃癌４１例，浅表性胃炎４８例，萎缩性胃炎３０例，胃溃疡８例，其中伴肠化１９例，异型增生８例）中ＡＡＤ同工酶．以６０ｇ／Ｌ丙烯酰胺作支持递质，ｐＨ３５～５０和ｐＨ３５～１００两种载体两性电解质建立ｐＨ梯度，加匀浆液５０μｌ，阴极及阳极电极液分别用０２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ和０５ｍｏｌ／ＬＨ３ＰＯ４，恒压电泳（１０℃）１８ｈ后以亮氨酰β萘胺作为基质呈色．结果ＡＡＤ分为８条区带，从阳极到阴极依次命名为ＡＡＤⅠ～ＡＡＤⅧ，其中ＡＡＤⅣ主要见于胃癌（９０２％），不完全大肠型肠化（８６７％）和异型增生（７５０％）；而不伴有肠化或异型增生的良性胃病和正常胃中则未发现．ＡＡＤⅣ的阳性率与胃癌病理类型、细胞分化程度及临床分期无相关，且ＡＡＤⅣ等电点和胎盘型ＡＡＤ等电点相当．结论ＡＡＤⅣ是一种癌胚蛋白，即胃癌组织特异性同工酶，是癌前期病变及早期癌的标志物．     

胰腺癌CFPAC1细胞增殖诱导配体基因shRNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的shRNA慢病毒表达载体.方法 应用基因工程技术,筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列,与pGCL-GFP载体连接,构建慢病毒表达载体LV-shAPRIL;将连接产物转化到DHSα感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.再用LV-shAPRIL、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒.重组慢病毒感染CFPAC1细胞,实时定量PCR和Western blotting检测CFPAC1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达.结果 PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为5×107TU/ml.构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周,APRIL mRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73%、70%和71%;APRIL蛋白表达量分别下降了66%、63%和62%(P＜0.05).而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异(P＞0.05).结论 成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV-shAPRIL.     

鸟苷酸环化酶C基因沉默对人胃癌裸鼠皮下种植瘤的影响

目的:探讨鸟苷酸环化酶C(GC-C)基因沉默对人胃癌裸鼠皮下种植瘤的影响及其机制.方法:将SGC-7901细胞(SGC-7901组)、空质粒转染的细胞(PRNA组)、GC-C基因稳定沉默的细胞(GC-C-shRNA组)悬液先在裸鼠皮下接种成瘤,再取瘤组织块分别接种到裸鼠皮下,建立3种胃癌裸鼠皮下种植瘤模型.观察裸鼠一般情况、肿瘤的成瘤率、生长速度,描绘肿瘤的生长曲线,计算肿瘤的抑瘤率;采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR),Western blot和免疫组织化学法检测GC-C和趋化因子受体4(CXCR4)在各组移植瘤组织中的表达.结果:与SGC-7901组和PRNA组比较,GC-C-shRNA组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢、体积明显变小(抑制率分别为33.7%、33.2%),肿瘤异型性、坏死程度明显降低,差异具有统计学意义(均P<0.05),且移植瘤组织中GC-C和CXCR4 mRNA和蛋白均明显下调(GC-CmRNA:7.47±1.70 vs 11.18±0.60,11.28±0.85;GC-C蛋白:0.52±0.15 vs 1.04±0.19,1.03±0.24;CXCR4蛋白:0.67±0.13 vs 1.02±0.21,1.03±0.23,均P<0.05).结论:GC-C基因稳定沉默在体内能保持稳定,且能抑制裸鼠移植瘤生长,该过程可能与CXCR4下调有关.     

实时荧光定量PCR检测大肠癌患者外周血鸟苷酰环化酶C基因及其临床意义

目的:建立人鸟苷酰环化酶C(GC-C)含量实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测的新方法,观察大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平并探讨其临床意义.方法:在GC-C基因高保守区设计了特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,由软件自动计算出待测样本(30例健康献血员、11例大肠良性病变和37 例大肠癌)中GC-C mRNA准确含量,并以GC-C mRNA和β2微球蛋白 mRNA含量的比值作为评价GC-C表达水平的指标.结果:本法检测GC-C mRNA含量的线性范围为101 ～109 pg/ml,样本批内和批间变异系数(CV)值分别为6.87%～11.12%和8.86%～15.19%.30例健康献血员和11例大肠良性病变样本的PBMC中均未检出GC-C mRNA表达,大肠癌患者外周血GC-C mRNA的检出率为83.8%(31/37).大肠癌患者外周血PBMC GC-C mRNA表达水平为0.88±0.06,与Duke分期、淋巴结转移和肝转移密切相关,与年龄、性别、肿瘤大小等无关.结论:GC-C mRNA RFQ-PCR检测外周血大肠癌细胞具有较好的检测灵敏度、特异性和重复性,GC-C mRNA表达水平可能对指导大肠癌Duke分期、判断淋巴结转移和肝转移、指导术后综合治疗均有一定价值.     

人胰腺癌组织中增殖诱导配体蛋白的表达及意义

目的:观察人胰腺癌组织中增殖诱导配体(APRIL)蛋白的表达情况,探讨其与胰腺癌生物学行为的关系.方法:免疫组化染色法检测人胰腺癌组织(n=20)及正常胰腺组织(n=10)APRIL蛋白的表达,分析不同临床病理指标下胰腺癌组织中APRIL蛋白的表达.结果:胰腺癌组织中APRIL阳性率为90.0%(18/20),明显高于正常胰腺组织0(0/10).胰腺癌组织不同临床病理指标下(肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、有无远处转移、肿瘤大小),APRIL蛋白表达无显著差异.结论:APRIL蛋白表达可能与胰腺癌的发生、发展有关.     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)表达的影响,为后续的以APRIL基因为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出3条针对APRIL基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建3个重组慢病毒表达载体LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2、LV-APRIL shRNA3;将连接产物转化到DH5 α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-APRIL shRNA、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的3种重组慢病毒分别感染CFPAC-1细胞,实时定量PCR和Western印迹检测CFPAC-1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:3个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107 TU/ml.感染CFPAC-1细胞后,APRIL基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P＜0.05),其中LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2作用较明显,使mRNA表达分别下降73%和68%,蛋白表达分别下降66%和59%(P＜0.05);而未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无统计学差异.结论:成功构建针对APRIL基因的3个慢病毒载体LV-APRILshRNA,体外感染CFPAC-1细胞后可有效抑制APRIL基因和蛋白的表达.     

结直肠癌变过程中增殖诱导配体及其受体表达水平分析

目的分析结直肠癌发生各阶段组织中增殖诱导配体(APRIL)及其受体mRNA的表达水平。方法在APRIL及其受体基因的高保守区设计相应引物和荧光探针,实时检测PCR产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA的准确含量,并以靶基因和内参β2微球蛋白(β2M)mRNA含量比值作为评价靶基因表达水平的指标。结果批内和批间重复性测定的变异系数(cv)分别为6.52%~12.02%和8.76%~14.16%。APRIL在中、重度异型增生肠组织中的表达水平显著高于正常肠粘膜(P<0.05),在原位癌、浸润癌组织中的表达水平又显著高于正常肠粘膜(P<0.05),而其受体B细胞成熟抗原(BCMA)和穿膜蛋白活化物(TACI)在各种胃粘膜病变之间表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论APRIL在结直肠癌病变演进过程中呈现累积和渐进趋势,可能在结直肠癌发生、发展过程中起重要作用。