用Gateway技术克隆并表达汉滩病毒G1蛋白ITAM样基序

目的:克隆并表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白(G1)胞质区尾段ITAM样基序及其突变体.方法:采用RT-PCR方法,扩增HTNV G1蛋白ITAM样基序及其中2个保守酪氨酸残基突变基序编码基因,应用Gateway技术将目的基因克隆至pDESTTM15表达载体,在BL21-AI中经L-阿拉伯糖诱导表达,免疫印迹确证融合蛋白的表达.结果:成功地构建了2个含汉滩病毒G1胞质区尾段ITAM样基序编码序列表达载体pDEST- ITAM-L,pDEST-ITAM和1个含保守酪氨酸残基突变的G1 ITAM样基序编码序列表达载体pDEST-ITAM-YY-FF (Y615F,Y628F),并在大肠埃希杆菌中得到高效表达,免疫印迹证实目的蛋白与GST融合表达.结论:获得了3种与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的G1 ITAM样基序及其突变基序的重组蛋白, 为进一步探讨HTNV G1蛋白ITAM样基序在HFRS免疫信号传递中的作用奠定了基础.     

Syk或ZAP-70信号途径诱导脐带血CD4~+T细胞极化

目的:探讨IL-2或IL-4和基质细胞源因子(SDF)-1α协同刺激下,脐带血CD4+T细胞极化的作用及其与非受体型蛋白质酪氨酸激酶的关系。方法:流式细胞术、实时定量RT-PCR检测IL-2或IL-4和SDF-1α协同刺激下,CD4+T细胞中胞内Th1型和Th2型细胞因子的表达;免疫复合物激酶分析法和免疫印迹法检测Th细胞极化过程中非受体型蛋白酪氨酸激酶Syk和ZAP-70的磷酸化;反义肽核酸(PNA)技术探讨Syk和ZAP-70在协同刺激Th细胞极化过程中的作用。结果:L-2或IL-4和SDF-1α协同作用可通过Syk或ZAP-70磷酸化诱导CD4+T细胞极化;Syk或ZAP-70 PNA可明显阻断Syk或ZAP-70磷酸化以及CD4+T细胞极化。结论:Syk和ZAP-70磷酸化对于IL-2或IL-4和SDF-1α协同诱导CD4+T细胞极化十分重要。     

带核定位信号的RARα与JTV1蛋白相互作用的验证实验

目的 通过实验验证带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)与JTV1蛋白之间的相互作用.方法 将表达NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白的两种重组表达质粒共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术在体外验证二者之间的相互作用.结果 NLS-RARα诱饵蛋白和JTV1靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;NLS-RARα及JTV1蛋白标签融合表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行免疫印迹检测,可以检测到Myc-JTV1蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术验证了NLS-RARα与JTV1间存在相互作用.     

丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3与细胞核分离基因C相互作用的研究

目的 验证丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3,MAPK/ERK kinase kinase 3,MEKK3)与细胞核分离基因C(Nuclear distribution gene C,NudC)的表达产物NudC相互作用的真实性,以及探讨MEKK3是否为NudC的一个上游调控激酶.方法 构建了一系列的载体,通过GST-Pull down技术,免疫共沉淀技术,从体外和体内两个方面来验证MEKK3和NudC之间能否相互作用,又利用体外模拟磷酸化实验来证明MEKK3是否为NudC的一个上游调控激酶.结果 GST-Pull down以及免疫共沉淀技术显示MEKK3和NudC在体内和体外均能够相互结合,体外模拟磷酸化实验表明在体外野生型MEKK3可以磷酸化NudC,而激酶失活型MEKK3不能.结论 MEKK3和NudC之间能够相互作用,而且MEKK3可能为NudC的一个上游调控激酶.     

维甲酸诱导基因G抑制肿瘤细胞增殖的分子机制研究

目的探讨维甲酸诱导基因G（RIG—G）抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。方法应用转染实验、Western印迹法、免疫共沉淀和免疫荧光共定位等技术验证RIG—G蛋白与JAB1蛋白之间的相互作用,并研究RIG—G蛋白对JAB1蛋白功能的影响。结果RIG—G蛋白可以与JAB1蛋白发生相互作用,并影响JAB1蛋白在细胞内的定位和分布。实验发现,在NIH3T3细胞中单独转染JAB1时,JAB1蛋白在细胞核和细胞质内呈弥散分布,而当与RIG—G共同转染后,JAB1蛋白在细胞核内的含量明显减少,而改变为主要在胞质内分布,并与RIG—G蛋白发生部分共定位。此外,RIG—G蛋白还具有抑制JAB1对细胞周期抑制因子p27的辅助降解功能。结论RIG—G可以通过和JAB1的相互作用,使后者部分滞留在细胞质内,从而影响JAB1发挥正常功能,干扰其对p27的辅助降解,维持细胞内p27的稳定性,促进细胞退出增殖周期,抑制细胞增殖。     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用

目的 通过BioID-质谱联用技术建立一种新的蛋白质相互作用的筛选系统,并采用免疫共沉淀-蛋白质印迹法验证与Yes相关蛋白1(YAP1)相互作用的蛋白质.方法 构建YAP1-BirA*融合表达质粒,将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养基中加入50μmol/L生物素,继续培养24 h后提取细胞总蛋白质.利用YAP1特异抗体,采用蛋白质印迹法检测YAP1-BirA*融合蛋白的表达.利用HRP偶联的亲和素检测细胞内蛋白质被生物素标记的水平.通过亲和素磁珠对细胞内生物素化的蛋白质进行亲和纯化,多次洗涤去除亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白质后对亲和素磁珠纯化的蛋白质进行溶解.取40μg总蛋白行SDS-PAGE,然后采用蛋白质银染试剂盒对凝胶中的蛋白质进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果.用非标记定量质谱法鉴定生物素化的蛋白质.针对鉴定得到的蛋白质,采用蛋白质印迹法对生物素化的SMAD家族成员3(SMAD3)进行验证.通过YAP1的免疫共沉淀-蛋白质印迹法确定SMAD3能否与YAP1相互作用.结果 成功构建YAP1-BirA*融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白.在生物素存在的情况下,YAP1-BirA*融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与YAP1-BirA*融合蛋白邻近的蛋白质.在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白质能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白质.质谱鉴定显示,能够获得细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白质.免疫共沉淀-蛋白质印迹法结果证明SMAD3蛋白能与YAP1相互作用.结论 BioID-质谱联用方法是一种能用于蛋白质相互作用筛选的简单、高效技术,与免疫共沉淀-蛋白质印迹法联合使用可以成为一种新的蛋白质相互作用研究体系.     

胰腺癌Syk表达与病理分期及血管生成的相关性

目的研究胰腺癌中Syk的表达及其与病理分期、血管生成的关系。方法收集胰腺癌组织40例，另选9例慢性胰腺炎、8例正常胰腺组织标本为对照。应用免疫组织化学方法和RT-PCR检测Syk蛋白的表达，形态计量学图象分析法测定微血管密度（MVD）。结果慢性胰腺炎标本中Syk阳性率为77.8%（7/9）, 8例正常胰腺组织中Syk全部阳性表达；Syk蛋白在胰腺癌组织中呈低表达，阳性率为27.5%（11/40）；Syk阳性率与肿瘤的发生部位无关，而与TNM分期、分化程度和淋巴结转移有关（P均＜0.05）。PCR结果显示Syk在胰腺癌中呈低表达（P＜0.01）。MVD与胰腺癌的组织分化程度、TNM分期相关（P＜0.01），胰腺癌组织中Syk蛋白表达阴性者MVD高于阳性者（P=0.000）。结论Syk在胰腺癌中表达减低或缺失，与胰腺癌的发展相关，可能参与胰腺癌的血管生成和淋巴结转移的过程。     

一种新的中心体蛋白质TACP1与有丝分裂激酶Nek2A相互作用的研究

目的:研究一种新的中心体蛋白TACP1蛋白与有丝分裂激酶Nek2A在有丝分裂期的相互作用关系。方法:在大肠杆菌中表达和纯化的Nek2A305-446蛋白与293T细胞中表达的TACP1蛋白,进行体外pull-down实验;TACP1和Nek2A两种质粒共转染293T细胞,用TACP1多抗进行免疫共沉淀实验;Hela细胞共转TACP1和Nek2A,利用间接免疫荧光的方法在荧光显微镜下观察两种蛋白的亚细胞定位。结果:TACP1条带可以出现在大肠杆菌中表达和纯化的Nek2A305-446泳道中,而对照组中无TACP1条带。TACP1抗体可以将细胞裂解液中的Nek2A蛋白连同TACP1蛋白一起沉淀下来,而对照组免疫前的兔血清则不能将TACP1或Nek2A沉淀下来。在Hela细胞有丝分裂中期,TACP1和Nek2A都呈点状定位于中心体,两者信号叠加后也重合。结论:中心体蛋白TACP1在体内、体外能与有丝分裂激酶Nek2A相互作用,两者在细胞有丝分裂期都定位于中心体。     

端粒相关蛋白PinX1和磷酸化激酶Aurora A的相互作用

目的:鉴定端粒相关蛋白PinX1与有丝分裂期极光激酶(Aurora A)的相互作用及其功能,进一步研究PinX1调控参与细胞有丝分裂期的具体机制.方法:以pGBKT7-PinX1为诱饵对人HeLa细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的结果进行测序分析;构建Aurora A原核及真核表达质粒;采用免疫共沉淀及蛋白质体外沉降...     

Tec激酶区作用蛋白RAI16的筛选和结构功能分析

目的筛选与Tec激酶结构域相互作用的蛋白分子,并获得其蛋白质结构及功能信息.方法通过酵母双杂交技术筛选作用蛋白,利用相应的计算机软件及数据库,对筛库所得蛋白进行生物信息学分析.结果筛选得到1种Tec激酶区作用蛋白RAI16,其cDNA序列由2 863个核苷酸组成,编码759 aa蛋白质,具有多个功能基序,其中包括3个酪氨酸磷酸化位点.结论推测RAI16蛋白与细胞分化有关,很可能在肝癌细胞的诱导分化信号转导转录中与Tec协同发挥重要作用.     

Stable Expression of Hantavirus H8205 Strain G1/IL-2 Gene and Immune Protection of the Fusion Gene

To explore the feasibility of stable expression of Hantavirus H8205 strain G1 segment and human IL-2 fusion gene in Vero cells, and to examine the immune protection effects on mice vaccinated with this recombinant eukaryotic expression vector containing Hantavirus G1 gene and IL-2 gene. With the help of lipofectamine, the Vero cells were transfected with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 and the positive cells were selected by G418. IFAT and SDS-PAGE elec- trophoresis were used to determine the stable transfection and expression of recombinant protein. Each mouse was inoculated with plasmids intramuscularly (i.m.) three times, 2 boosts were given at 2-week intervals, serum anti-hantavirus antibodies were detected by ELISA and neutralizing antibod- ies (NAb) were detected by Plaque Reduction Neutralization Test. The fusion protein expressed in Vero cells was 78 kD, corresponding to the estimated molecular size. The neutralizing antibody titers of mice with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 were 1:20-1:80. IL-2/G1 fusion gene could be transferred in Vero cells and stably express the fusion protein. Specific humeral immune responses in mice can be induced with the recombinant eukaryotic expression vector containing the fusion gene, which lays the foundation for further development of therapeutic HTNV vaccine.     

牙本质基质蛋白1和肿瘤坏死因子-α对汉滩病毒感染的脐静脉内皮细胞的作用

目的  探讨肿瘤坏死因子-α和牙本质基质蛋白1对汉滩病毒感染的脐静脉内皮细胞通透性的影响,为阐明肾综合征出血热发病过程中通透性增高的机制提供实验基础。方法  首先用免疫细胞化学方法检测牙本质基质蛋白1在脐静脉内皮细胞的表达情况,然后通过Transwell单层细胞模型系统检测外源性肿瘤坏死因子-α和牙本质基质蛋白1对汉滩病毒感染的血管内皮细胞通透性的影响。结果  牙本质基质蛋白1可以在血管内皮细胞表达,汉滩病毒感染对牙本质基质蛋白1表达量无显著性影响,汉滩病毒感染后加入肿瘤坏死因子-α使牙本质基质蛋白1表达量显著性增加（P <0.05）。单纯汉滩病毒感染后,通透性无显著性变化（P > 0.05）,而感染细胞加入外源性肿瘤坏死因子-α或牙本质基质蛋白1后,内皮细胞通透性显著增加（P <0.05）,两者联合作用能促进通透性进一步增加（P <0.05）。结论  牙本质基质蛋白1广泛表达在血管内皮细胞,肿瘤坏死因子-α和牙本质基质蛋白1均可使汉滩病毒感染的脐静脉内皮细胞通透性显著增高,且两者存在联合作用。

     

GST-hPBD融合蛋白的克隆、表达及活化Rac1蛋白的分析

目的:制备GST-hPBD融合蛋白,探讨活化的Rac1在血管内皮细胞中的表达. 方法:采用RT-PCR方法克隆与活化Rac1相结合的hPBD基因片段,构建pGEX-2T/hPBD原核表达载体,并纯化GST-hPBD融合蛋白;应用pull down测定血管内皮细胞中活化Rac1的蛋白表达. 结果:基因测序证实原核表达载体pGEX-2T/hPBD序列正确,并在大肠杆菌中高效表达,纯化得到纯度约75% GST-hPBD融合蛋白,其Mr为36 000;进一步分析证实血管内皮细胞可表达活化的Rac1蛋白. 结论:成功构建了人pGEX-2T/hPBD原核表达载体,纯化了GST-hPBD融合蛋白,并检测到血管内皮细胞中活化Rac1蛋白的表达.     

弓形虫分泌蛋白ROP5的全基因原核重组表达与抗原性鉴定

目的在大肠杆菌工程菌中重组表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白5(ROP5)的融合蛋白GST-6×His-ROP5,并初步评价重组蛋白的抗原性。方法体外细胞培养弓形虫速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP5基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,最后通过Western blotting鉴定重组蛋白rROP5的抗原性。结果构建了弓形虫ROP5全基因重组表达质粒,诱导表达了GST-6×His-ROP5融合蛋白,分子量为96 kDa,与预测结果相符,重组蛋白与人源抗血清有显著免疫印迹反应。结论本研究获得了弓形虫ROP5全长重组蛋白,为进一步改进弓形虫诊断抗原,研究蛋白结构以及分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

蟾酥注射液逆转HL60/阿霉素细胞多药耐药的机制

目的探讨蟾酥注射液(CHS)对人类白细胞多药耐药细胞系HL60/阿霉素细胞的逆转作用机制。方法 MTT法测定CHS预作用后HL60/阿霉素细胞对阿霉素的敏感性;流式细胞术考察CHS对HL60/阿霉素细胞周期的影响;免疫组化考察CHS对HL60/阿霉素细胞NF-κB、MRP、GST-π、iNOS蛋白表达的调节作用。结果 CHS可将阿霉素对HL60/阿霉素细胞的IC50值由34.1971μmol/L降至17.4393μmol/L,逆转倍数为1.9609倍;FCM显示CHS作用后HL60/阿霉素阻滞于G0/G1期、G2/M期,降低进入S期比例,并出现凋亡峰;免疫组化结果显示,CHS能下调HL60/阿霉素细胞中MRP、GST-π表达,上调NF-κB、iNOS的表达。结论蟾蜍注射液逆转HL60/阿霉素细胞的多药耐药性可能是通过下调MRP、GST-π的表达,上调NF-κB、iNOS的表达,促进HL60/阿霉素细胞凋亡,从而增加HL60/阿霉素细胞对药物的敏感性。     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样结构域的原核表达、纯化及活性鉴定

目的获得小鼠血管内皮生长因子Ⅱ型受体（mVEGFR2）胞外1-4IgG 样结构域融合蛋白并验证其免疫原性及生物活
性。方法利用RT-PCR法从孕龄14 d的Balb/c小鼠胚胎组织中扩增mVEGFR2D1-4基因,测序正确后将其克隆至原核表达载
体pET-42a,构建重组质粒pET-42a-mVEGFR2D1-4。将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,
目的蛋白用Western blotting鉴定后,亲和层析法纯化融合蛋白,ELISA法检测纯化蛋白的抗原活性,并通过体外细胞培养检测
该融合蛋白对血管内皮生长因子（VEGF）促人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的阻断作用。结果测序结果证实成功扩增出目
的基因mVEGFR2D1-4;酶切和测序结果证实pET-42a-mVEGFR2D1-4 原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化
出大小与预期一致的蛋白;Western blotting 证实纯化的蛋白能与特异性抗体发生反应;ELISA 检测显示纯化后的
mVEGFR2D1-4融合蛋白具有免疫原性,并且体外细胞培养试验证实其能阻断VEGF对HUVEC的促增殖作用。结论成功获
得mVEGFR2D1-4/GST融合蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性及生物活性,为进一步研究以VEGFR2为靶点的抗肿瘤主动免
疫治疗奠定了基础。
     

Effects of Hantaan virus on human endothelial cells and their significance in pathogenesis of hemorrhagic fever with renal syndrome.

The effects of Hantaan virus (HTNV) on human endothelial cells (HECs) were investigated both in vivo and in vitro. The 76-118 strain or SR-11 strain of HTNV were inoculated into HECs monolayers respectively, and the virus antigens could be detected on the seventh day of the first passage after inoculation by immunofluorescent technique. The HTNV could also be isolated through cultures of Vero E-6 cells. HTNV particles and inclusion bodies together with various changes in the organelles were observed in the infected cells by transmission electronic microscopy (TEM), and the immunoenzyme positive virus particles were seen by immunoelectronic microscopy. Samples of skin biopsy were individually obtained from 14 cases of hemorrhagic fever with renal syndrome on the second to the fifth day after the onset of the illness. It was found that HTNV antigens were widely distributed in the cytoplasm of endothelial cells of the samples from 5 out of 14 cases by avidin-biotin-peroxidase complex staining, and morphologic changes of the endothelial cells similar to those observed in vitro, were also seen by TEM. The results indicated that HEC is one of the target cells susceptible to HTNV. The virus could invade and propagate in HECs, and could induce damage to the latter.

     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。