神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化研究

神经生长因子是分子量26 000道尔顿的多肽。在神经元的发育,分化及生存中起着重要的作用。神经母细胞瘤的发生可能为神经母细胞的分化受到某种阻滞的结果。因而有人推测神经生长因子可能诱导神经母细胞瘤的细胞分化,但世界范围内尚无肯定的结论。我们应用18个神经母细胞瘤系系统研究了神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的规律和特点。我     

ATRA对NB细胞增殖抑制及诱导分化作用的研究

目的；通过对神经母细胞瘤（NB）细胞系SH－SYT6和SMS－KCNR的体外实验，探讨全反式维甲酸（ATRA）对NB细胞增殖抑制的可能分子机制及脑源性神经营养因子（BDNF）－TrkB信号转导途径在NB细胞分化中的作用。方法：通过台盼蓝拒染计数活细胞，用倒置相差显微镜观察加药处理前后细胞形态学变化。结果：5μmol/L ATRA抑制NB细胞系SMS－KCNR和SH－SY5Y细胞增殖，而5nmol/L ATRA无此作用；ATRA可诱导SMS－KCNR细胞分化成熟，对SH－SY5Y细胞诱导分化作用极弱；BDNF可使经ATRA处理的SY5Y细胞发生显著形态学分化。结论：5μmol/L ATRA对人NB细胞系SMS－KCNR和SH－SY5Y细胞的体外增殖有抑制作用；ATRA能诱导人NB细胞系SMS－KCNR细胞分化成熟，ATRA与BDNF共同作用可使1SH－SY5Y发生显著形态学分化；BDNF－TrkB信号转导途径的激活可能是ATRA体外诱导NB细胞分化逆转的分子生物学机制之一。     

神经营养因子相关基因在骨髓基质细胞分化为神经元中的表达

目的:体外诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞,并观察诱导分化前后神经营养因子及其受体相关基因的表达变化.以探索骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的可能机制.方法:体外培养经 Percoll(1.073 g/L)分离获得的大鼠骨髓基质细胞并传代扩增,用二甲亚砜(DMSO),丁羟回醚(BHA)诱导分化,采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,分化后细胞用神经丝蛋白(NF)抗体,胶质源性纤维酸性蛋白(GFAP)抗体作细胞免疫荧光检测.采用半定量RT-PCR检测分化前和分化后2 h,6 h.12 h,24 h和48 h神经生长因子(NGF),脑源性神经因子(BDNF),神经营养因子-3(NT-3)及其相应受体TrkA,TrkB,TrkC和神经营养因子低亲和力受体p75NTR的表达变化.结果:①骨髓基质细胞体外诱导分化后2 h即出现形态学变化.表现为细胞胞体呈球形,突起增多,形态类似神经元.细胞免疫荧光检测显示神经丝蛋白(NF)抗体标记的神经元细胞阳性,GFAP阴性.②在骨髓基质细胞分化前后都有NGF和BDNF持续表达,但分化后NGF表达降低,TrkA,TrkB在分化前细胞中不表达.在诱导分化开始后12 h可以检测到他们的表达,而NT-3,TrkC 在分化前后都不表达.③p75NTR在诱导分化后6 h开始出现表达,12 h后显著降低并很快消失.结论:骨髓基质细胞在体外可以定向诱导为神经细胞,诱导分化前后神经营养因子(NT)及其 Trk 受体和p75受体的表达发生了显著变化,NT与Trk受体及p75受体作用的信号途径可能在骨髓基质细胞分化为神经细胞过程中起重要作用.     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

CNTF 联合RA 诱导成肌细胞类神经分化及与REST 的相关性

目的 探讨睫状神经营养因子（CNTF）联合视黄酸（RA）诱导成肌细胞类神经分化的方法以 及该诱导过程与神经元限制性沉默因子（REST）相关性。方法 以CNTF 诱导C2C12 去分化,再以RA 诱导 C2C12 类神经分化。通过细胞形态学、细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot 等技术对去分化及类神经 分化的细胞进行鉴定及相关分析,比较细胞类神经分化前后REST 表达变化。结果 诱导后细胞聚集生长,呈 典型的神经球样。细胞免疫荧光染色显示神经球能够被神经特异性标志物NSE、Sox1、GFAP 标记,神经球 离散为单个细胞接种后生长状态良好,神经干细胞标志物（nestin）呈阳性表达。Western blot 结果显示CNTF 去分化诱导后成肌细胞分化相关蛋白Myogenin、P21 表达降低,类神经分化后NSE、Sox1、GFAP 表达增多, 且成肌细胞特异性标志物Desmin 及REST 表达下降。流式细胞仪分析表面标志物NSE 显示诱导组与对照组 比较细胞有差异,且诱导组特异性阳性细胞率达84% 左右。结论 CNTF 联合RA 可诱导成肌细胞类神经分化, 且该诱导过程可能与REST 表达降低相关。     

Γ干扰素诱导功能性TrkA的表达激活NGF/TrkA传导通路诱导原代神经母细胞瘤细胞分化的实验研究

目的在骨髓转移的神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）细胞及人KP-N-RT细胞系中分别应用IFN-γ、NGF及联合应用IFN-γ和NGF作为诱导剂诱导NB细胞分化。方法NB骨髓转移细胞的原代培养以及人KP-N-RT细胞系培养10d。第10天在原代培养细胞及KP-N-RT细胞中应用RT-PCR法检测TrkA表达水平;同时应用Western法和免疫沉降法检测KP-N-RT细胞中TrkA及磷酸化TrkA蛋白表达的不同。结果第10天观察细胞形态学变化,在NB原代培养及KP-N-RT细胞中同时负荷IFN-γ和NGF的细胞表现出比单独负荷IFN-γ或NGF更加显著的形态学分化（P〈0.01）。前者细胞增殖抑制明显（P〈0.01）。在IFN-γ组,TrkAmRNA表达增加,NGF组未见明显改变,联合用药组有明显减少或消失。在KP-N-RT细胞中,在25IU/mLIFN-γ处理的细胞中用NGF刺激5min可致磷酸化TrkA蛋白表达增加。结论IFN-γ通过磷酸化NGF受体激活NGF/TrkA信号传导系统诱导NB细胞的分化,甚至在侵袭性表型的NB中也有相似结果。     

Nogo-C对PC12细胞分化和突起生长的影响

目的:利用PC12细胞研究Nogo-C和神经元细胞分化及突起生长的关系. 方法: NGF诱导PC12细胞,利用RT-PCR及免疫荧光技术检测细胞内Nogo-C的表达,并在PC12细胞中过表达Nogo-C,通过细胞计数检测Nogo-C对突起生长的影响. 结果: ① RT-PCR检测到NGF诱导的PC12细胞中有少量Nogo-C的mRNA分子表达;②免疫荧光染色观察到NGF诱导的PC12细胞中有少量Nogo-C的表达;③细胞计数观察到转染Nogo-C后的PC12细胞在NGF诱导后突起增长百分数相对于EGFP组明显增高. 结论: NGF诱导的PC12细胞中有Nogo-C的表达,同时过表达Nogo-C可促进NGF诱导下的PC12细胞的分化以及影响细胞的突起生长.     

神经节苷脂GM1对神经生长因子诱导PC12细胞分化的影响

目的 研究神经节苷脂GM1是否介导神经生长因子（NGF）诱导的PC12细胞的分化。方法 采用MTT法、葡萄神经酰胺合成抑制剂（D－PDMP）分析神经节苷脂GM1对NGF诱导的PC12细胞分化的影响。结果 神经节苷脂GM1对PC12细胞的生长无明显的影响，而能够促进NGF对PC12细胞的生长抑制作用；NGF能诱导PC12细胞分化，但NGF无法诱导神经节苷脂缺乏型PC12细胞的分化；在神经节苷脂缺乏型PC12细胞中添加神经节苷脂GM1后，细胞恢复对NGF的反应性。结论 神经节苷脂GM1在NGF诱导的PC12细胞分化过程中发挥重要作用。     

不同生长因子对神经干细胞定向分化的影响

目的 研究神经干细胞（NSCs）分化为神经元和胶质细胞的影响因素,探讨各种生长因子对小鼠NSCs定向分化的影响。方法 以无血清培养法从E13-14d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs后,分别加入50 mg/L EGF、bFGF、IGF-1、NGF和PDGF处理,分析不同生长因子对NSCs定向分化的影响。结果 分离得到的细胞表现出NSCs的特性,能无限增殖,神经元微管相关蛋白和胶原纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组相比,各生长因子均可显著诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中NGF的诱导NSCs分化为神经元的作用最强;IGF-1、NGF、PDGF均能明显诱导NSCs分化为星形胶质细胞。结论 几种生长因子均能促进NSCs分化,其中NGF诱导NSCs向神经元方向作用最强;而IGF-1、NGF和PDGF促进NSCs向星形胶质细胞分化的作用均较强。     

p27KIPI与神经母细胞瘤分化的研究

目的：探讨p27^KIPI在神经母细胞瘤诱导分化及预后的作用。方法：用BrdU诱导神经母细胞瘤细胞系TGW的分化，免疫组化法分析神经母细胞瘤分化过程中p27^KIPI的表达，Western blot法分析p27^KIPI的总体表达水平。结果：BrdU引起p27^KIPI的表达明显增加，主要位于细胞浆，p27^KIPI的表达使神经母细胞瘤细胞株的生长停滞，p27^KIPI在诱导分化作用下蛋白质表达的总体水平增加。结论：p27^KIPI的表达与神经母细胞的分化呈正相关，p27^KIPI可以抑制神经母细胞瘤的生长并可以成为以促进肿瘤细胞分化的基因治疗方案的基础。     

维甲酸联合神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(MSCs)向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法:将人脐血间充质干细胞体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸(RA)、维甲酸联合神经生长因子(NGF)诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,并比较表达神经元特异性烯醇化酶(NES)mRNA、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA的差异。结果:两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示三种诱导方法诱导后均表达Nestin、NSE、GFAP,NGF+RA组多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但两种诱导方法诱导后表达上调(P<0.05),添加NGF较单纯RA组上调明显(P<0.05)。结论:脐血MSCs经两种神经营养因子诱导法均可分化为神经样细胞,并表达神经细胞特异性标志物,其中添加NGF后较单纯应用RA诱导效果好。     

三七总皂甙对大鼠骨髓基质细胞分化为神经样细胞中NGF表达的影响

目的 研究三七总皂甙(Panax notoginseng saponins, PNS)对大鼠骨髓基质细胞(bone marrow strowal cells,BMSCs)分化为神经样细胞中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)表达的影响.方法 分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),实验分对照组、诱导组、PNS组,分别采用常规培养液,常规培养液加入二甲亚砜(DMSO)、丁羟回醚(BHA)的诱导分化液及含100mg/L PNS的诱导分化液培养;观察细胞形态学变化,采用免疫组化及ELISA法了解细胞Nestin及NGF的表达.结果 骨髓基质细胞体外诱导分化6h即出现形态学变化,表现为细胞胞体呈球形,突起增多,形态类似神经元.免疫组化显示Nestin染色阳性;诱导组、PNS组NGF表达明显低于对照组(P＜0.01),PNS组高于诱导组(P＜0.05～P＜0.01).结论 骨髓基质细胞在体外可以定向诱导为神经细胞,诱导分化后NGF表达下降,PNS可以促进其神经诱导后NGF的表达.     

三氧化二砷抑制神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖及诱导凋亡的初步研究

目的：探讨三氧化二砷（AS2O3)抑制神经母细胞瘤SK－N－SH细胞增殖及诱导凋亡的作用。方法：①采用MTT法测定不同浓度的As2O3在不同时间对SK－N－SH细胞增殖的抑制率；②用TUNEL－POD法检测不同浓度的As2O3诱导SK－N－SH细胞凋亡的情况。结果：①各浓度组As2O3均可抑制SK－N－SH细胞增殖，而且延长作用时间比增加作用浓度更能增强药物的抑制作用；②两个浓度的As2O3均可诱导SK－N－SH细胞凋亡，且凋亡指数与浓度高低有关。结论：As2O3可以通过诱导神经母细胞瘤SK－N－SH细胞凋亡而抑制其增殖，有一定的临床应用价值。     

脂肪组织来源的基质细胞向神经元样细胞分化

目的：研究脂肪来源的基质细胞向神经元样细胞分化的可能性，为神经移植探索新的细胞来源。方法：采用β-巯基乙醇诱导脂肪来源的基质细胞向神经元样细胞分化，以免疫细胞化学方法对分化的和未分化的细胞进行鉴定。结果：从成年大鼠的脂肪组织中分离出基质细胞，在体外生长形态类似成纤维细胞，可以维持在未分化状态稳定增殖，体外扩增可超过10多代。β-巯基乙醇可诱导这种细胞向神经元样细胞分化，分化的细胞早期表达巢蛋白，后期则表达神经元的标志物——神经元特异性烯醇化酶和神经微丝，在最适合的诱导条件下约60％～85％的细胞表达这两种神经元的标志物。结论：脂肪组织中存在能分化为神经元样细胞的干细胞。     

环腺苷酸对脑胶质瘤细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨环腺苷酸（cAMP）对大鼠神经胶质瘤细胞C6的诱导分化作用。方珐：C6细胞经不同浓度的cAMP诱导后,应用MTT分析法、软琼脂克隆形成、电镜检测、流式细胞仪、GFAP免疫组化染色及TUNNEL染色等法,检测C6细胞的分化及凋亡情况。结果：0．2mmol／L cAMP即可诱导C6细胞分化,表现为增殖抑制、细胞突起增长增多、G1期阻滞、GFAP高阳性表达、线粒体增多．细胞核变小等。且有浓度依赖关系,10mmol／L cAMP可诱导出现凋亡。结论：cAMP可明显抑制C6细胞增殖、诱导细胞分化甚至凋亡。     

K562细胞向不同细胞系分化时bcl-6表达变化及其机制

目的 研究诱导K562细胞向不同髓系细胞系定向分化过程中bcl-6表达变化及其机制，以探讨bcl-6与K562细胞定向分化的关系。方法 以Western blot方法检测TPA（tetradecanoylphorbol 13-acetate）、羟基脲（Hu）及HMBA（hexamethylene bisacetamide）为诱导剂分别诱导K562细胞向巨核细胞系、红细胞系及巨噬细胞系分化时bcl-6表达变化。PCR、克隆、直接DNA测序方法分析bcl-6基因5′调控区序列变异情况。结果 bcl-6仅在TPA诱导K562细胞向巨核细胞分化时表达上调，bcl-6基因5′调控区序列未发现有突变发生。结论 bcl-6可能是调控K562细胞向不同细胞系定向分化的关键基因，在TPA诱导的K562细胞向巨核细胞分化过程中发挥重要作用，TPA诱导的K562细胞bcl-6表达上调与其调控区基因变异可能无关。     

四种癌基因在急性髓细胞性白血病中转录水平的分析

用滤膜原位杂交方法，对M2、M3、M5和M6四型共18例急性髓细胞性白血病外周血和／或骨髓细胞中c－myc、c—fos、c—sis和c－N－ras4种癌基因的转录水平进行分析．结果表明：①c-myc在M2、M3、M5和M64型井13例中表达．②6例M3中，3例同时检测到c－myC和c－N－ras表达。③7例M5中，检测到3例c-fos表达。     

视黄酸受体基因在人胚肾上腺及神经母细胞瘤中的表达

目的　探讨视黄酸受体基因在人胚肾上腺和神经母细胞瘤中表达的意义。方法　应用原位分子杂交的方法 ,检测人胚肾上腺发育过程中视黄酸受体基因表达的水平 ,以及不同分化程度的神经母细胞瘤视黄酸受体基因的表达 ,并对表达程度进行半定量分析。结果　在胎儿肾上腺神经母细胞中 ,RARαmRNA、RARγmR NA明显表达并逐渐增强 ,1 9周龄后则急剧下降。RARβmRNA、RXRαmRNA表达稍弱 ,在 1 9周龄前基本保持同一水平。RXRβmRNA在 1 9周龄前一直是微弱表达。RXRγmRNA表达呈明显下降趋势。在胎儿肾上腺嗜铬细胞以及胎儿区和最终区的细胞中 ,6个mRNA均为微弱表达或基本不表达。在神经母细胞瘤细胞中 ,RAR类mRNA以及RXRαmRNA、RXRβmRNA在分化不良组中均明显表达 ,在分化良好组中表达减弱。两组相比均有显著性差异 (P <0 .0 1 )。RXRγmRNA在神经母细胞瘤中不表达。结论　 (1 )RARα、RARγ可能参与了神经母细胞分化的介导 ;(2 )视黄酸受体基因表达水平与神经母细胞瘤的分化程度呈负相关 ;(3)孕 2 0周之前的肾上腺发育延滞可能与神经母细胞瘤的发生有关。     

小脑髓母细胞瘤的超微结构研究

目的 探讨髓母细胞瘤的组织学起源和细胞分化潜能。方法 运用透射电子显微镜５例髓母细胞瘤进行微结构的观察。结果 依超微结构的不同,将髓母细胞瘤细胞分为４型：①未分化型;②中间型;③神经细胞分化型;④星形细胞分化型。结论 髓母细胞瘤是一种原始神经上皮源性肿瘤,它具有向神经元和胶质细胞双向分化的能力。     

人胚胎干细胞向下丘脑神经祖细胞的诱导分化受高雄激素影响

目的：研究体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）向下丘脑神经祖细胞分化,并以此为细胞模型,观察不同浓度雄激素对下丘脑神经祖细胞分化的影响。方法：鉴定hESC细胞株CCRM22,体外诱导CCRM22向下丘脑神经祖细胞分化,对其进行初步的细胞生物学鉴定;在分化培养基中添加1×10-8mol/L、1×10-7mol/L睾酮（以无水乙醇为助溶剂对照）,收集不同分化时期细胞,比较分化效率;利用RT?qPCR、流式细胞术、免疫荧光检测等方法鉴定分化细胞,并检测生殖功能调控相关基因的表达。结果：CCRM22分化为下丘脑神经祖细胞的效率超过85%,但睾酮处理降低其分化效率;分化细胞表达神经细胞标志物NESTIN以及下丘脑神经祖细胞特异性标志物NKX2.1,同时表达KISS1和雄激素受体（androgen receptor,AR）,且AR的表达水平与睾酮浓度呈正相关。结论：成功诱导hESC分化形成下丘脑神经祖细胞,高浓度睾酮处理抑制hESC向下丘脑神经祖细胞分化,该细胞模型可应用于后续体外研究多囊卵巢综合征女性孕早期高雄激素环境对后代下丘脑神经细胞分化和发育的影响。