结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85A编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVAXl中，转化大肠杆菌DH5α，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段，以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性，重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段，所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株，该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。     

利用PCR结合膜芯片技术检测结核分支杆菌的实验研究.

目的:探讨聚合酶链反应(PCR)结合膜芯片技术用于检测结核分支杆菌的方法.方法:标记生物素的特异性引物,扩增17株菌标本IS6110插入序列的245 bp目的基因,结合膜芯片杂交检测结核分支杆菌基因.结果:15株结核分支杆菌标本中有12株扩增出245 bp目的基因,2株大肠杆菌及阴性对照标本PCR扩增结果为阴性.经膜芯片杂交,12株结核分支杆菌标本中有11株显色结果为阳性,其余显色结果为阴性.PCR结合膜芯片检测结核分支杆菌的灵敏度为73.3%,特异度为100%.结论:PCR结合膜芯片技术是一种具有发展潜力的检测结核分支杆菌的方法.     

生物芯片法在结核分支杆菌检测中的应用价值探讨

目的 探讨生物芯片法在结核分支杆菌诊断中的价值.方法 对生物芯片法的特异度、重复性和灵敏度进行方法学评价,并用生物芯片法检测79例临床怀疑结核的患者标本和56例非结核患者标本,将其结果同传统抗酸染色法进行比较.结果 在方法学实验中,生物芯片法重复性好,特异性高,灵敏度高.临床试验中,79例怀疑结核标本,生物芯片法检出率为49.4%(39/79)高于抗酸染色法19.0%(15/79),差异有统计学意义(χ2=13.87,P<0.05); 而56例非结核患者检测结果均为阴性.结论 生物芯片法是一种快速、灵敏度好、特异性高、重复性好的结核分支杆菌辅助诊断方法.同时生物芯片法能区分结核分支杆菌和非结核分支杆菌,在流行病学、临床诊断和治疗上有着重要意义.     

长春地区非结核分枝杆菌试验结果分析

目的:证明检测非分枝杆菌对临床诊断及选用抗结核药物起关键作用。方法:应用BG/ALERT3D检测法、改良罗氏(L-J)培养法及分枝杆菌的鉴定程序。结果:从516份临床患者标本中检测出213株结核分支杆菌,其中结核分支杆菌(188/213)、牛型分支杆菌(14/213)、非结核分支杆菌(11/213),结核分支杆菌的培养阳性率为37.8%。结论:按MTC鉴定程序对213株结核分支杆菌进行了鉴定,11株为非结核分支杆菌,其中海分支杆菌3株、堪萨斯分支杆菌3株、胞内氏分支杆菌2株、偶然分支杆菌2株、鸟分支杆菌1株,长春地区非分支杆菌约占5.2%左右。     

PstS1-卡介苗重组疫苗的构建

目的：构建结核分支杆菌分泌蛋白磷酸盐特异转运系统1（PstS1）的重组卡介苗。方法:以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增获得PstS1基因序列;将PstS1基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达质粒PMD31重组,得到S-PMD31重组质粒,对S-PMD31重组质粒进行HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌,用IPTG对工程菌株进行诱导表达,并通过电穿孔技术将S-PMD31重组质粒导入卡介苗中构建重组卡介苗。结果：用引物P1、P2对结核分枝杆菌H37R_V基因组进行PCR扩增获得长为1 100 bp的PstS1基因序列,S-PMD31重组质粒的HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定证实：PstS1基因正确插入载体PMD31中,并能在大肠杆菌中诱导表达。通过质粒提取及PCR扩增表明重组质粒正确导入卡介苗中。结论：成功地构建了PstS1重组卡介苗,预期能提高卡介苗的免疫原性和保护力。     

用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB, KatG, rpsL基因突变

目的：用PCR－SSCP技术检测肺结核患者痰及分离株结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，了解耐药分子机制及探索痰标本结核分支杆菌耐RFP，INH，SM直接检测的可行性，方法：对32例耐INH，RFP，SM肺结核患者临床痰标本及30株耐INH，RFP，SM结核分支杆菌临床分离株行PCR－SSCP方法检测rpoB,KatC,rpsL基因突变，结果：32份耐多药临床痰标本中rpoB,KatG,rpsL基因扩增产物SSCP其电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比，基因突变阳性分别为28／32，19／32，23／32，30例结核分支杆菌临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变阳性为28／30，18／30，22／30，结论：PCR－SSCP方法敏感，特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，适合于临床肺结构患者痰标本耐药性的快速检测。     

噬菌体裂解法与BACTEC-460法检测结核分支杆菌的应用比较

目的 :比较研究噬菌体裂解法与BACTEC - 46 0法在结核分支杆菌快速检测及鉴定中的价值。方法 :应用噬菌体裂解法和BACTEC - 46 0法检测 3株结核分支杆菌标准株、13株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌以及 2 70份临床确认的肺结核患者的痰标本。结果 :噬菌体裂解试验 3株结核分支杆菌标准株均为阳性 ,而 13株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌均为阴性 ;BACTEC - 46 0法 3株结核分支杆菌和 13株非结核分支杆菌均可生长 ;2 70份肺结核患者的痰标本应用噬菌体裂解法和BACTEC - 46 0法进行检测两者的阳性率相近 ,分别为 4 4.4 % (12 0 / 2 70 )和 4 6 .7% (12 6 / 2 70 ) ,二者差异无显著性 (p >0 .0 5 )。噬菌体裂解法检测的报告时间为 2d ;BACTEC - 46 0培养的阳性报告时间 2～2 7d、平均为 8.7d ,阴性报告时间为 4 2d。结论 :噬菌体裂解法与BACTEC - 46 0法相比 ,可以简便、快速地检测结核分支杆菌 ,全程只需 2d ,并且具有较高的敏感性和特异性 ,是一种崭新的结核分支杆菌快速检测方法。     

肉芽肿性病变的巨细胞形态学的计算机图像分析研究

目的:探讨巨细胞形态学定量分析在皮肤软组织肉芽肿性病变中的诊断与鉴别诊断价值。方法:选择偶发分支杆菌(MF)肉芽肿、异物性肉芽肿、结核性肉芽肿及骨巨细胞瘤各10倒进行组织病理学观察,并应用形态计量学分析方法对组织切片中的巨细胞参数进行测定。结果:MF肉芽肿的形态学及巨细胞参数与异物性肉芽肿、结核性肉芽肿及骨巨细胞瘤的巨细胞有所不同。结论:结合临床病理特点及巨细胞形态计量学检测,对皮肤软组织肉芽肿性病变的诊断与鉴别诊断有一定价值。     

尿素酶试验在结核分支杆菌耐药性测定中的应用

目的利用尿素酶试验的方法对结核分支杆菌的耐药性进行检测。方法采用液体结核分支杆菌的培养基加尿素和酚红指示剂，高压消毒灭菌，将分离纯培养鉴定的500株结核分支杆菌接种其中，再加入不同浓度的抗结核分支杆菌的药物进行培养。同时用传统的绝对浓度法对500株结核分支杆菌进行耐药性测定，观测并比较结果。结果500株尿素酶法与传统的绝对浓度法检测结核分支杆菌耐药性结果比较，差异无统计学意义（Χ^2=2．25，P〉O．10）。结论利用尿素酶试验对结核分支杆菌的耐药性进行检测，方法快速、简便，有临床实际意义。     

Identification of Mycobacterium marinum 65 kD heat shock protein gene by polymerase chain reaction restriction analysis from lesions of swimming pool granuloma

Background Nontuberculous mycobacterium （NTM） had been reported to cause cutaneous infections which are difficult to interpret due to the variability of the clinical manifestations. Among NTM infections, Mycobacterium marinum （M. marinum） are mostly seen to cause skin infection. It is therefore important to establish a rapid approach for detection and identification of M. marinum from lesions of patients with suspected M. marinum infections. Methods Specimens were obtained from 5 patients with swimming pool granuloma. DNA was extracted and polymerase chain reaction （PCR） was performed. PCR products were digested with Hae III and BstE II, then analysed by pattern restriction analysis to detect heat shock protein （hsp） 65 kD gene. Results The 65 kD hsp gene was found in all specimens from patients with swimming pool granuloma. PCR restriction analysis （PRA） identified all 5 samples to be M. marinum infections, and the result was consistent with that of routine bacteriological identification. The lesions subsided or markedly improved upon treatment. Conclusions PRA is a sensitive, specific and rapid method in identification of mycobacteria. Application of this method will be helpful for early diagnosis of mycobacterial skin infections.     

基因芯片快速鉴定分枝杆菌菌种方法的建立

目的：利用基因芯片技术,建立一种能快速、准确鉴定分枝杆菌菌种的方法,并验证其临床应用价值。方法根据23种分枝杆菌基因序列设计特异性探针并制作基因芯片,通过PCR‐反向点杂交鉴定23种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和103株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果应用基因芯片技术检测23种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,特异性为100％。103株临床分离株经鉴定87株为结核杆菌复合群（MTC）;16株为非结核分枝杆菌（NTM）,其中脓肿分枝杆菌5株、胞内分枝杆菌3株、鸟分枝杆菌3株、偶发分枝杆菌2株,以及堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌各1株。103株临床分离株鉴定结果与测序法完全一致,该方法最低检出限为103copy／mL。结论采用基因芯片技术能快速鉴定分枝杆菌菌种,并区分MTC和NTM,具有简便快速及准确性、特异性、灵敏度高的优点。     

用聚合酶链反应技术诊断结核病

用聚合酶链反应技术对结核杆菌特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因１２３ｂＰ的片段进行扩增。该法检测人型结核杆菌灵敏度可达到１０ｆｇＤＮＡ，对１４９份结核患者临床标本检测结果显示ＰＣＲ总阳性率（６９．１％）明显高于直接涂片荧光镜检（１５．４％）与细菌培养（１０．１％）的阳性率（Ｐ＜０．０１）。研究表明ＰＣＲ是一种特异、敏感、快速诊断结核病的好方法，值得推广。     

不同检测方法在骨结核诊断中的应用效果比较

目的:比较利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF,简称"Xpert")、荧光PCR熔解曲线法及液体培养方法在骨结核诊断中的应用效果。方法:收集2017年1月至2018年12月期间166例疑似骨结核患者的脓液标本,分别进行分枝杆菌液体培养(MGIT960培养)、Xpert与荧光PCR熔解曲线法检测。以临床综合诊断为标准,对3种检测方法的敏感度和特异度进行比较分析;以液体药敏为金标准,评价Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的敏感度和特异度。结果:Xpert检测的敏感度分别高于荧光PCR熔解曲线法和MGIT960培养法,荧光PCR熔解曲线法的敏感度高于MGIT960培养法,差异有统计学意义(P<0.05);以MGIT960培养为标准,Xpert的敏感度高于荧光PCR熔解曲线法,差异有统计学意义(P<0.05);Xpert与荧光PCR熔解曲线法的特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05);以液体药敏为金标准,Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测利福平的敏感度和特异度均为80.0%和100%,两种方法与金标准进行一致性检验Kappa值均为0.872。结论:Xpert和荧光PCR熔解曲线法在骨结核诊断中的敏感性和特异度均优于液体培养方法,两种方法各有千秋,可根据实际情况选择。     

Polymerase chain reaction for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis

Polymerase chain reaction (PCR) based on the amplification of a 169 bp DNA fragment specific for the Mycobacterium tuberculosis complex was evaluated for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis (TBM). A total of 105 CSF specimens from clinically suspected cases of TBM were studied. Clinical details of the cases and cytochemical parameters of the CSF specimens were recorded. For PCR 10 CSF specimens from cases other than TBM, 4 non-mycobacterial culture isolates (one strain of E coli, one strain of proteus species and 2 strains of salmonella species) and one sample of sterile distilled water were processed as negative controls. For positive control standard culture of Mycobacterium tuberculosis H37Rv was processed with every batch of specimens. Besides PCR, smear for AFB by the Ziehl-Neelsen (ZN) and the fluorochrome method and culture on Lowenstein-Jensen medium was also carried out. By PCR, 31.42% specimens were found positive, whereas by conventional culture on Lowenstein-Jensen medium only 3.8% specimens were positive.     

PCR方法鉴定结核分枝杆菌临床分离株

目的:用3对引物PCR扩增的方法对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.方法:将3对特征性的结核分枝杆菌标记基因:MPT40基因、α抗原基因和IS6100插入序列,分别放入PCR体系中,在各自的退火温度下进行PCR扩增,通过对扩增产物的不同带型进行分析,对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.结果:用3对引物PCR扩增的方法可将各种类型的结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌鉴别开.结论:3对引物PCR扩增的方法是一种有效的结核分枝杆菌菌种鉴定的方法,可用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌以及各种类型的结核分枝杆菌的区分.     

PCR-SSCP分支杆菌菌种初步鉴定方法的建立及其应用

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法：通过聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）－单链构象多态性（Ｓｕｉｎｇｌｅ－ｓｔｒｎｄｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｌｏｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＳＳＣＰ）方法分析分枝杆菌１６ＳｒＲＮＡ,根据其电泳图谱与标准株的相似性进行菌种初步鉴定。结果：２９种分支杆菌标准株中,除结接分支杆菌、牛结核分支杆菌和卡     

PCR技术应用于临床结核病的诊断研究

采用PCR(聚合酶链反应)技术,选择一对寡核苷酸引物,扩增的靶基因为克隆的PH_重组标准人型结核分枝杆菌2.4kb DNA。其基因片段是结核杆菌所特有,单一拷贝基因,与其他非典型分枝杆菌的基因无同源序列。研究结果表明:①扩增了人型和牛型结核杆菌标准株基因DNA 158bp 片段,而其他14种非典型分枝杆菌和金黄色葡萄球菌、脓杆菌 DNA 未扩增出相应产物.②10倍系列稀释人型结核菌 DNA,检测敏感性相当于10～50菌数/ml痰样。③60例临床肺结核病人痰样进行 PCR 技术检测和常规生物法测定比较,前者阳性率为58.3%,后者检测率11.70%。而20例非结核痰样用两种方法检测全为阴性。提示:PCR 技术诊断结核病快速、简易、特异、敏感、高效,是在基因水平上检测的一种新技术。     

聚合酶链反应对肺结核的诊断价值

对７０例肺结核和２０例其它肺部疾病患者行痰及血标本ＰＣＲ检测、痰培养和涂片镜检结核菌。结果表明肺结核组痰ＰＣＲ阳性率为６４．３％，血ＰＣＲ阳性率为１１．４％，培养阳性率为３０．０％，涂片阳性率为２４．３％。其它肺部疾病ＰＣＲ阳性率为１０％，血ＰＣＲ为０，涂片阳性率为０，培养阳性率为０，表明痰ＰＣＲ特异性好，敏感性高，且快速，与临床符合率较高，不失为结核病的诊断和鉴别诊断的一种可靠的方法。