重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探

目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin 4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性.方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性并异.结果 GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉和环丙沙星.结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景.     

人β-防御素4基因在COS-7细胞中的转染表达

目的探讨人β-防御素4（HBD4）基因在真核细胞COS-7中表达的可能性。方法用脂质体转染法将实验室已构建的重组真核表达载体pcDNA3.1＋/HBD4导入COS-7细胞,采用RT-PCR、Western-blot法检测HBD4的mRNA和蛋白表达水平,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果 pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞中检测到HBD4mRNA表达。Western blot分析显示,在pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby-Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对大肠杆菌ATCC25922具有较强的杀伤作用。结论在COS-7细胞中成功表达具有抗菌活性的HBD4多肽。     

乳源抗菌-免疫调节融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建乳铁蛋白抗菌肽(Lfcin B)与免疫调节肽(PGPIPN)融合肽表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达及纯化.方法 采用重叠延伸PCR技术获得融合肽基因片段,并构建到原核表达载体pGEX-KG中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白.用Glutathione Sepharose 4B亲和层析方法纯化融合蛋白.结果 成功构建原核表达质粒pGEX-KG-FP,并在大肠杆菌BL21中诱导其高表达.SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗GST单克隆抗体所识别的融合蛋白分子量与理论值相近.经Glutathione Sepharose 4B纯化后,得到较纯的GST-FP融合蛋白.结论 构建了原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该融合蛋白.     

人β-防御素4基因在HEK293细胞中的转染表达

目的人β-防御素4(humanβ-defensin 4,HBD 4)对多种病原菌有杀伤作用。HBD4的自然表达水平极低,体外获得难度较大且价格昂贵。利用基因工程技术生产重组的HBD4成为研究的焦点。文中旨在构建HBD4真核表达载体,探讨真核细胞表达HBD4的可行性。方法用PCR法从已构建的重组克隆载体pMD18-T/HBD4中扩增出HBD4全长编码基因,克隆入真核表达载体pEGFP-N2,构建pEGFP-N2/HBD4重组真核表达载体;通过脂质体转染法将pEGFP-N2/HBD4导入HEK293细胞,采用RT-PCR、荧光显微镜、Western blot检测HBD4的mRNA和蛋白表达情况,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果构建的重组真核表达载体pEGFP-N2/HBD4,经酶切鉴定、测序,证实插入的序列与Genebank中的HBD4基因序列完全相同。将pEGFP-N2/HBD4转染HEK293细胞,在转染细胞检测到HBD4mRNA表达。荧光显微镜下可在细胞膜及细胞质中观察到绿色荧光。Western blot分析显示:在pEGFP-N2/HBD4转染的HEK293细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby—Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对铜绿假单胞菌具有较强的杀伤作用。结论成功构建了HBD4基因的真核表达载体,并在HEK293细胞中表达出具有抗菌活性的HBD4多肽。     

用原核翻译增强子提高人成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达

目的 用原核翻译增强子提高人成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达。方法 将原核翻译增强子序列插入到质粒pRIT-2T启动子的下游，再与成骨生长肽融合蛋白基因重组。热诱导表达融合蛋白，经亲和层析、Factor Xa酶切、凝胶过滤层析得到纯化的成骨生长肽。结果 提高了成骨生长肽基因在大肠杆菌中的表达水平，使成骨生长肽融合蛋白的表达量超过了大肠杆菌蛋白总量的50％。结论 原核翻译增强子可提高外源基因在大肠杆菌中的表达。插入了原核翻译增强子的pRIT-2T质粒可作为高效表达融合蛋白的通用质粒载体。     

小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

中华按蚊防御素基因的克隆、原核表达及其重组产物生物活性的初步评价

目的 克隆、原核表达中华按蚊的防御素基因，并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊防御素基因序列设计合成两对引物．以中华按蚊成蚊cDNA为模板进行PCR扩增，将预期片段克隆测序并进行分析；根据表达质粒pET32a( ）上的克隆位点及测序结果设计PCR引物．将截短的基因片段重组入质粒pET32a( )中进行表达．纯化表达产物并进行体外抑菌试验。结果 PCR扩增产物大小约270bp．目的基因的序列与冈比亚按蚊防御素基因同源性为85％；截取其保守功能区域序列(162bp)．构建成功重组表达质粒pET32a( )-tDEF，含重组质粒的转化菌用IPTG诱导表达后，于Mf26000处可见一预期的特异表达带，该蛋白与抗6-His抗体有特异性的反应；琼脂扩散法显示，纯化的重组防御素融合蛋白未出现抑菌环。结论首次克隆了中华按蚊防御素基冈．其截短片段在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达，但重组融合蛋白不具备抑菌活性。     

β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达

目的：探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2的可行性。方法：采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2（rBD2）基因片段，定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中，重组质粒pShuttle-CMV-rBD2转化E．coli BJ5183-AD-1后，与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1发生同源重组，重组质粒pAdEasy-rBD2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装。将包装成功的腺病毒感染cos-7细胞，并建立SD大鼠腺病毒感染模型，进行β-防御素2多肽的体外和体内表达，采用Western blot与免疫组化方法检测其表达。结果：重组腺病毒表达载体构建成功，包含大鼠β-防御素2基因，滴度达到10^9PFU／ml，Western blot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达。结论：重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：体外表达人源性MT-1E融合蛋白并进行纯化。方法：采用RT-PCR方法获得人MT-1E基因的编码区，将其克隆入原核表达载体pQE40，并在大肠杆菌M15中表达，对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析。用Ni-NT agarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果：重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在。但以不可溶性形式为主。表达量随诱导时间延长而增加，在诱导8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的32％。经亲和层析获得较高纯度的人MT-1E融合蛋白。结论：利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT-lE融合蛋白。为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。     

Soluble expression and characterization of the immunoreactive multiepitope antigen of Toxoplasma gondii in E.coli]

OBJECTIVE: To obtain soluble expression product of immunoreactive recombinant multiepitope antigen of Toxoplasma gondii from E.coli. METHODS: The gene encoding the multiple epitopes (MEG) of Toxoplasma gondii was amplified by PCR from the original plasmid containing MEG gene and cloned into the prokaryotic soluble expression vector pET32a. After identification by enzyme digestion and sequencing, the positive recombinant plasmid pET32a-MEG was transformed into BL21(DE3), which was induced with IPTG for expression of the target antigen. The relative molecular mass, solubility and antigenicity of the expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. RESULTS: The recombinant expression plasmid pET32a-MEG was successfully constructed and the highly efficient expression of the antigen was achieved after IPTG induction of E.coli. Improvement of the induction condition increased the expression product which accounted for about 28% of the total bacterial protein. The target protein, with good solubility and a relative molecular mass of about 31 000, was purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and could be well recognized by mouse and rabbit antisera derived by infection of the animals with Toxoplasma gondii B36 and RH, respectively. CONCLUSION: The recombinant multiepitope antigen has good antigenicity and potential value in diagnosis and vaccine development of toxoplasmosis.     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET2a相匹配的酶切位点,插入载体pET2a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果 该基因在原核表达系统中经诱导,得到了M_r1000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B6感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.     

Expression and purification of recombinant human hemangiopoietin in Escherichia coli

Objective： To express the soluble recombinant hemangiopoietin protein in E. coli BL21 （DE3）. Methods： Using human fetal live cDNA as a template, a partial cDNA fragment of HAPO coding N-terminal region was subcloned into plasmids pTrc99, pQE60 and pET32c to construct different recombinant prokaryotic expression systems. After selecting, the soluble rhHAPO fusion protein was expressed stably in E. coli BL21 （DE3） by vector pET32c-HAPO and further isolated by nickelnitrilotriacetic acid （NTA） affinity chromatography. After cleavage with enterokinase, the rhHAPO protein was applied to Fast Flow SP sepharose column. Results： The rhHAPO protein had a purity of more than 95% and a good bioactivity based on the cell adhesion assay in ECV304 cells. Conclusion： We have established a protein engineering system to produce rhHAPO which may provide the possibility for clinical application     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16E7基因，经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体，转化JM109感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7，HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达，在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增出目的基因,与pMD18-T载体连接后,转化至大肠杆菌DH5α中,大量扩增后提取克隆质粒,连接至原核表达载体pEP-30a(+)中,转化BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG),最佳诱导条件为80μmol/LIPTG诱导3h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54600,主要以不溶性的包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3g/L,经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统,该系统可高效表达重组AHSG蛋白,该蛋白具有良好的抗原性。     

人解痉多肽原核表达载体的构建及诱导表达

目的:构建人解痉多肽(hSP)原核表达载体,表达重组hSP,为功能研究奠定基础。方法:通过RT-PCR获得hSPcDNA片段,将目的基因插入原核表达载体pET32a,得到重组载体pET32a-hSP。IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析及WesternBlot检测。结果:经测序及PCR证实,hSPcDNA准确插入原核表达载体pET32a中,诱导表达后SDS-PAGE分析证明hSP的分子量约为32kD,Western-blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论:上述结果表明成功构建出原核表达载体pET32a-hSP,获得重组hSP,并为深入研究hSP奠定了基础。     

M istic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶 Fat-1在大肠埃希菌中高效表达

目的：构建真核膜蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat‐1基因的重组原核表达质粒pET32a‐Fat‐1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a‐Mistic‐Fat‐1;将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21（DE3）,IPTG诱导表达Fat‐1蛋白和M110‐Fat‐1蛋白,通过十二烷基‐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）灰度分析其表达量,蛋白免疫印迹法（Western blot）进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a‐Fat‐1和pET32a‐Mistic‐Fat‐1原核表达载体;SDS‐PAGE和Western blot证实ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1在原核表达系统中没有明显诱导表达,而M 110‐Fat‐1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达,占全细胞蛋白总量的15％。结论ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因与Mistic基因融合表达,实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。