大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的 探讨获得足够数量和较高纯度大鼠胰岛的分离和纯化方法.方法 采用V型胶原酶灌注消化法分离成年大鼠胰岛,Ficoll 400非连续密度梯度法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)染色鉴定培养的胰岛细胞,锥虫蓝染色检测细胞活性.葡萄糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛细胞的功能.结果 分离纯化后大鼠胰岛平均收获量为(480±30)IEQ,纯度大于90%,活性大于90%.在低糖和高糖刺激下,胰岛素分泌量分别为(12.28±0.89)mIU/L、(19.01±1.49)mlU/L,二者相比较.差异有统计学意义(P<0.05),刺激指数为(1.55±0.01).结论 胶原酶V逆行灌注消化胰腺和Ficoll400非连续密度梯度纯化法,可获得高纯度高活率的大鼠胰岛.     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的寻找简便、高效的大鼠胰岛分离纯化方法,并对纯化胰岛细胞的基本生物学状况进行鉴定。方法采用胰管内注射胶原酶水浴消化以及Ficoll400不连续密度梯度离心法纯化,用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO/PI染色计算胰岛细胞存活率;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和糖尿病大鼠移植判定胰岛细胞功能。结果纯化后获得(738±193)个胰岛细胞/每只胰腺,纯度为(77±13)%,纯化后细胞形态完好,活度大于95%,体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,低糖情况下胰岛素分泌量为(24.31±5.47)mIU/L,高糖情况下为(37.62±4.29)mIU/L,两者有显著性差异(P<0.05),胰岛移植后,实验组48h后血糖值降至正常,维持(3.9±1.7)d。结论采用胰管内胶原酶灌注进行大鼠胰岛分离及Ficoll400不连续密度梯度法纯化可获得较高纯度和活度的胰岛细胞。     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化方法。分离成年Wistar大鼠胰岛,葡聚糖密度梯度离心纯化。大鼠胰腺消化后,胰岛收获量为710～1015个/胰腺,纯化后胰岛收获量为610—820个/胰腺,纯度达92%。纯化胰岛形态结构完整,内分泌细胞超微结构保持良好;对葡萄糖刺激反应,胰岛素释放量是基础分泌水平的8倍;异体移植可逆转实验性糖尿病小鼠的高血糖达一周。     

简便快捷的小鼠胰岛分离纯化方法研究

目的 探讨小鼠胰岛分离与纯化的方法.方法 采用多点注射灌注胶原酶法消化胰腺,不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法分离、纯化胰岛.双硫腙特异性染色后计算胰岛产量及纯度.葡萄糖刺激后测定培养上清液胰岛素水平检测胰岛功能.结果 (1)每只小鼠采用上述分离、纯化法平均得到(114±15)个胰岛,平均纯度为(77.12±3.23)％,胰岛细胞存活率＞90％; (2)分离、纯化的胰岛培养上清液中胰岛素水平在无糖、低糖(2.8 mmol/L)和高糖(22.2 mmol/L)刺激下分别为(23.80±3.52) mIU/L、 (67.57 ±4.04) mIU/L和(164.32±10.75) mIU/L,各组间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).两两比较,低糖组的胰岛素水平为无糖组的2.84倍(P＜ 0.05),高糖组的胰岛素水平为低糖组的2.43倍(P＜0.05),高糖组的胰岛素水平为无糖组的6.90倍(P＜0.05).结论 采用多点注射灌注胶原酶法消化胰腺,不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法分离、纯化的小鼠胰岛产量及纯度较高,形态完整,不同浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌反应良好,是一种简便、快捷的小鼠胰岛分离方法.     

NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究?方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll 密度梯度离心方法,分离纯化NOD 小鼠胰岛?应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖?体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE 染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况?结果 胰岛产率为(116 ±12)个胰岛/胰腺,纯度>90%?体外糖刺激实验结果显示,NOD 小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM 小鼠胰岛?胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖?体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2 周左右?HE 染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润?结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD 小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究?     

半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的 探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法.方法 使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(38 6201±78 219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231 420±28 054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的3.53倍(P≤0.001).结论 成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性.     

犬胰岛的分离与纯化

目的探讨影响胰岛分离与纯化结果的相关因素,寻找获得足够数量、高纯度、具有活性的胰岛细胞的方法,为临床胰岛移植应用提供实验基础。方法寻找自动分离技术连续分离22只犬的胰岛,连续性密度梯度离心法纯化胰岛,观察分离纯化出来的胰岛细胞大体形态、超微结构,用葡萄糖刺激释放实验检验其活性。结果纯化前胰岛计数平均为（155040±310）IEQ／胰腺,纯化后的胰岛平均计数为（74200±185）IEQ／胰腺,纯度约为（89．4±2．6）％,回收率约为（47．8±1．3）％,活率达到（93．0±1．7）％。胰岛分离纯化的结果无论在数量上还是在质量上都随着分离技术的不断更新,操作技术的娴熟而有很大提高。葡萄糖刺激释放实验显示低糖组与高糖组比较P〈0．001,提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好。结论从犬中分离和纯化出足够数量的胰岛细胞,可用于临床研究。     

大鼠胰岛分离纯化和功能分析的研究

目的:探讨大鼠胰岛分离纯化的方案.方法:采用胰管内灌注胶原酶V消化、Histopaque-1077密度梯度离心分离纯化20只雄性SD大鼠胰岛.椎虫蓝染色判断胰岛存活率,双硫腙染色后计数胰岛,葡萄糖刺激胰岛素释放实验评估胰岛功能,同种异体胰岛门静脉移植治疗5只链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠,监测血糖变化.结果:分离纯化后平均胰岛得率为(646±67)个/大鼠,存活率达到90%以上.新鲜分离的胰岛呈椭圆或圆形,悬浮于培养液面,胞膜光滑完整,直径大于150μm的细胞团占95%以上.葡萄糖刺激的胰岛素释放试验结果表明:第1、3、5天胰岛的刺激指数分别为2.6倍、1.7倍和1.4倍,两组间低糖和高糖的胰岛分泌量差异均有显著性(P＜0.05).胰岛门静脉移植术后,第2天大鼠血糖降至11.1 mmol/L,8天内血糖可控制在15 mmol/L以下,随后血糖逐步升高.结论:采用胰管内灌注胶原酶V消化联合Histopaque-1077分离纯化是一种较好的大鼠胰岛分离方法,胰岛得率较高且功能良好.     

小鼠胰岛α细胞的缺失对移植胰岛功能的影响

目的　探讨胰岛α细胞的丢失对胰岛素分泌功能的影响。方法　在人胰岛分离过程中 ,经胶原酶的过度消化造成胰岛周边α细胞缺失 ,用免疫组化及胰岛素 /胰高糖素含量分析予以证实。在体外 ,检测葡萄糖刺激引起的实验性糖尿病小鼠胰岛素的分泌 ;在体内 ,评价胰岛移植后对糖尿病小鼠血糖的调节 ,并研究胰高糖素对α细胞缺失胰岛功能的影响。结果　胶原酶的过度消化引起胰岛周边的α细胞丢失 ,使分离胰岛内胰岛素 /胰高糖素比值明显升高。与正常胰岛相比 ,α细胞缺失胰岛对葡萄糖刺激产生的胰岛素明显降低 ,胰岛素释放在正常胰岛和α细胞缺失胰岛分别为2 2 2 7uU/ml± 32 1uU/ml和 12 4 6uU/ml± 12 6uU/ml(P <0 0 1)。在体内 ,移植α细胞缺失的胰岛到糖尿病的C5 7/BL小鼠后不能有效地纠正动物的高血糖 ,胰岛移植后的平均血糖浓度在正常胰岛组和α细胞缺失胰岛组分别为 :8 9mmol/L± 1 98mmol/L和 2 1 3mmol/L± 2 2mmol/L(P <0 0 1) ,而给予外源性的胰高糖素可以在体外及体内明显改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。结论　胰岛α细胞的缺失明显降低胰岛的胰岛素分泌功能 ,用外源性的胰高糖素可以改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。     

小鼠胰岛密度梯度离心方法的研究

目的探索最优的密度梯度离心方案,提高胰岛的纯度和得率,为胰岛移植相关研究奠定基础。方法采用雄性Balb／c小鼠作为供体分离胰岛,以0.5mg／ml胶原酶Xl灌注和消化胰腺,通过不同的密度梯度离心策略分离纯化胰岛,进行双硫腙（DTZ）特异染色法染色,显微镜下观察胰岛的纯度和得率,并通过吖啶橙（AO）／碘化丙啶（PI）染色检查分离获得的胰岛活性,最终确定最佳的密度梯度离心方法。结果Balb／c小鼠在Ficoll一1．108（4m1）、1．096（2m1）、1．069（2m1）、HBSS（2m1）,加速度1、减速度1、400r／min、4min中转1800r／min、8min离心后胰岛得率为（125±39）IEQ、纯度为（79．6±105）％,经相同条件二次梯度后得率无明显降低但纯度明显提高．达（96．2±14）％。经AO／PI染色鉴定分离胰岛活性良好。结论本研究所采用的小鼠胰岛密度梯度离心方法很有效,能稳定地获得纯度较高且数量可观的胰岛。     

聚乙二醇对同种小鼠胰岛移植后抗排斥治疗的影响

目的 探讨聚乙二醇(PEG)包埋小鼠胰岛细胞对同种小鼠胰岛移植物存活的影响,以及其与抗排斥药雷帕霉素共同应用对胰岛移植后抗排斥治疗的影响.方法 选取C57BL/16雄性小鼠皮下预血管化糖尿病模型,行BALB/c小鼠胰岛移植.随机分为6组:A组:正常胰岛移植组.B组:PEG包埋胰岛移植组.C组:正常胰岛移植+雷帕霉素1.5 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.D组:PEG包埋胰岛移植+雷帕霉素1.5 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.E组:正常胰岛移植+雷帕霉素3 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.F组:PEG包埋胰岛移植+雷帕霉素3 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.观察小鼠血糖变化,病理检测移植物存活情况.结果 B组胰岛存活时间(25.5±5.9)d较A组(14.7±2.6)d明显延长(P<0.01),C组胰岛存活时间(35.0±3.1)d,D、E、F组胰岛于移植后6周均存活.HE染色下B组较A组炎症反应轻,胰岛结构完整.免疫组化染色显示B组有散在染色增强细胞团而A组未见.结论 PEG包埋胰岛细胞可显著延长移植物的存活时间,并能减少免疫抑制剂雷帕霉素的用量.     

Formation of amyloid in human pancreatic islets transplanted to the liver and spleen of nude mice

In previous studies we have shown that apparently normal human islets, transplanted under the renal capsule of nude mice, frequently and rapidly develop amyloid deposits derived from the beta-cell hormone islet amyloid polypeptide (IAPP). In the present study, we show for the first time that human islets, transplanted into the liver or spleen of nude mice, also develop islet amyloid rapidly. Ultrastructural studies of such islets showed that the first aggregation of IAPP takes place within the beta-cells and that extracellular deposits show up later in the amyloid formation process. We also found that the amount of amyloid formed in human islet grafts placed under the kidney capsule increased with extended (26 weeks) observation time. Moreover, prolonged in vitro culture (14 days) prior to the implantation under the renal capsule seemed to enhance the formation of amyloid in the grafted islets. Since aggregated IAPP has been shown to be toxic to beta-cells, the finding of amyloid deposits in transplanted islets offers a possible explanation to the frequent loss of function of islets transplanted into diabetic patients.     

糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.     

成人胰岛细胞的分离与纯化

目的 探讨体外分离与纯化成人胰岛细胞的方法与可行性,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法获取的成人胰腺组织称重后,采用V型胶原酶消化法分离;再用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化;在DTZ染色显微镜下,评价胰岛细胞的数量、纯度;并用体外培养、放射免疫测定胰岛素法鉴定胰岛细胞活性。结果成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量（3600±447）个／g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,胰岛平均收获量（2140±207）个／g胰腺,纯度〉70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,测定其培养液中基础胰岛素浓度（mIU·L^-1·100^-1）分别为（3．302±1．63）、（3．504±1．10）、（2．921±1．13）。结论胶原酶消化法、Ficoll间断密度梯度离心纯化法分离纯化成人胰岛是有效的方法。     

胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究

目的 通过比较胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的功效,探讨胰岛移植的最适宜部 位。方法 链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠,将其分为胃浆膜组、门静脉组、对照组,每组6 只;经胆总管灌注 胶原酶Ⅺ消化胰腺组织,分离、纯化胰岛,采用双硫腙（DTZ）特性染色并计数胰岛当量（IEQ）及纯度,台 盼蓝染色判断胰岛活性;同期分别将500 IEQ 大鼠胰岛移植入胃浆膜下层和门静脉,对照组输注等量RPMI 1640 液体,移植后分别检测大鼠的血糖浓度,腹腔葡萄糖耐量实验,评判胰岛功能。结果 每只大鼠可获取 胰岛（310±42）个,DTZ 染色显示胰岛纯度为（89.00±4.52）% ;台盼蓝染色显示胰岛活性良好[（89.08± 3.76）%] ;胰岛移植后胃浆膜组、门静脉组大鼠血糖较之前下降（P <0.05）,与对照组血糖浓度比较,差异有 统计学意义（P <0.05）;胃浆膜组与门静脉组胰岛移植后大鼠血糖浓度比较,差异有统计学意义（P <0.05）; 胃浆膜组与门静脉组大鼠有效控制血糖时间分别为（18.0±1.9）和（11.6±2.5）d,差异有统计学意义（P <0.05）。 胃浆膜组与门静脉组大鼠腹腔葡萄糖耐量实验提示糖耐受功能良好。结论 短期内,胃浆膜下层胰岛移植治 疗糖尿病大鼠的疗效优于门静脉移植;与门静脉相比,胃浆膜下层胰岛移植操作简单,安全性高,是胰岛移植 的最适宜部位之一。     

Fas配体表达对同种胰岛移植的影响

目的探究睾丸细胞FasL表达能否对共移植的胰岛移植物提供免疫豁免作用以及胰岛细胞FasL基因转染对同种胰岛移植的影响。方法　将同种大鼠胰岛及睾丸细胞同时移植于糖尿病受体，重组腺病毒AdV-FasL感染胰岛细胞后移植，观察移植物存活情况、胰岛功能，并检测移植物内浸润淋巴细胞以及基因转染胰岛细胞凋亡情况。结果　单纯移植胰岛组平均存活期为(6.3±0.6)d。与胰岛细胞同时移植的睾丸细胞数增加至1×107时，存活期大于50d（P<0.05）。表达FasL的睾丸细胞在移植物内诱导浸润淋巴细胞凋亡。FasL基因转染组出现排斥加速，存活期缩短至(3.4±0.2)d。FasL转染的胰岛细胞在移植后24h见FasL表达，48h表达增强，移植后FasL转染胰岛细胞凋亡。结论　表达FasL的睾丸细胞与胰岛同时移植可诱导活化的淋巴细胞凋亡，使胰岛移植物获得免疫豁免、存活期延长，但通过FasL基因转染使胰岛细胞直接表达FasL引起胰岛细胞凋亡和粒细胞浸润，导致排斥加速。     

生理盐水负荷对大鼠胰岛移植物原发性无功能的预防作用

目的 :观察生理盐水负荷对胰岛移植物原发性无功能的影响 ,以期寻找新的治疗原发性无功能的方法。方法 :建立链脲霉素诱导的大鼠糖尿病模型和左肾被膜下同种胰岛移植模型。术后实验组大鼠给予生理盐水负荷 ,对照组不给任何处理 ,通过测定血糖值判定移植物的功能。结果 :①注射链脲霉素后 4d～ 7d进行胰岛移植时 ,未见原发性无功能 (PNF)。注射链脲霉素后 9d以上时进行胰岛移植 ,在无生理盐水负荷的条件下 ,全部出现PNF ,两者差异显著 (P <0 0 1)。②对照组PNF的发生率为 10 0 % ,而附加生理盐水负荷后PNF发生率减少到 5 0 % ,两组差异非常显著 (P <0 0 1)。③把培养时间从 4h增加到 12h时 ,PNF的发生率从 5 0 %增加到 70 %和对照组无差异 (P >0 0 5 )。结论 :同种胰岛移植术后给予生理盐水负荷 ,可以预防胰岛移植物原发性无功能的发生。延长胰岛培养时间 ,可诱发胰岛移植物原发性无功能的发生。