miR-125b-5p修饰脐带间充质干细胞介导JAK2/STAT3信号通路对系统性红斑狼疮的免疫调节作用

目的 研究miR-125b-5p修饰脐带间充质干细胞(UC-MSCs)介导JAK2/STAT3信号通路对系统性红斑狼疮(SLE)的免疫调节作用。方法 UC-MSCs的分离、培养及鉴定;密度梯度离心法分离SLE患者外周血单个核细胞(PBMCs),实时荧光定量PCR检测与各组UC-MSCs共培养48 h后的PBMCs中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素17A(IL-17 A)、叉头状转录因子3(Foxp 3)基因的相对表达量;Western blot检测治疗后MRL/lpr小鼠肾组织中Janus激酶2(JAK2)、磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、磷酸化信号转导与转录激活因子3(p-STAT3)、白细胞介素18(IL-18)蛋白的相对表达量。结果 与PBMCs组相比,UC-MSCs+miR-125b-5p组、UC-MSCs+miR-NC组、UC-MSCs组的IFN-γ、IL-17 A的表达和辅助性T细胞17(Th 17)/调节性T细胞(Treg)的细胞比例显著下调(P<0.01),UC-MSCs+miR-125b...     

SOCS3经JAK/STAT信号通路调控气道黏蛋白高分泌

目的 研究细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)在炎症情况下经JAK/STAT通路调控气道黏液高分泌.方法 培养人气道16HBE上皮细胞,设置空白对照组、白介素(IL)-6处理组、IL-6和microRNA (miR)-203处理组,Westernblot法分析细胞中磷酸化JAK激酶(p-JAK1/2)、SOCS3、黏蛋白(MUC) 5AC蛋白水平;Real-time法检测各组细胞中SOCS3、STAT3、MUC5AC mRNA表达量;ELISA法检测各组培养上清液中p-JAK1/2、SOCS3、MUC5AC蛋白含量.结果 在IL-6刺激下,IL-6处理组的p-JAK1/2、SOCS3、MUC5AC蛋白量及SOCS3、STAT3 mRNA含量较空白对照组显著升高(P＜0.05),IL-6和miR-203处理组的p-JAK1/2、MUC5AC蛋白量及STAT3 mRNA含量较IL-6处理组显著升高(P＜0.05),但SOCS3 mRNA与IL-6处理组比较差异无统计学意义,SOCS3蛋白含量较IL-6处理组显著降低(P＜0.05).结论 细胞在IL-6刺激后SOCS3呈现高表达,同时经JAK/STAT信号通路负反馈调控MUC5AC.     

成人微小病变肾病患者外周血CD4~＋Foxp3~＋调节性T细胞的研究

目的研究CD4＋Foxp3＋调节性T细胞（CD4＋Foxp3＋Treg）及亚群在成人微小病变肾病（MCD）患者外周血CD4＋T细胞中的分布,探讨CD4＋Foxp3＋Treg参与MCD发病的可能机制。方法以27例经肾穿刺活检确诊为MCD的初发成人患者作为研究对象,采用Foxp3-FITC/CD45RA-PE/CD3-ECD/CD4-PC7抗体组合经流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4＋Foxp3＋Treg及亚群占CD4＋T细胞的百分比。Real-Time PCR检测PBMCs中Foxp3、Th17转录因子RORc以及细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达。设立正常对照。结果流式细胞检测显示CD4＋Foxp3＋Treg分成3个细胞群体,分别为CD45RA＋Foxp3low（Ⅰ区,静息期Treg）、CD45RA-Foxp3high（Ⅱ区,活化Treg）和CD45RA-Foxp3low（Ⅲ区）。MCD组Ⅰ区＋Ⅱ区细胞和Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比显著低于对照组（P〈0.01）。MCD组PBMCs中Foxp3mRNA表达较对照组下调（P〈0.05）,RORcmRNA表达较对照组上调（P〈0.05）,IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达均显著高于对照组（P〈0.05和P〈0.01）。相关性分析显示,MCD组IL-17A mRNA表达与Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比呈显著负相关（r=-0.81,P〈0.05）。结论成人MCD患者外周血Treg及其活化功能亚群减少,同时伴有Th17转录基因及其相关细胞因子表达的异常升高。提示Treg Foxp3 mRNA表达下调及Treg/Th17细胞比例失衡可能与MCD的发病有关。     

慢性乙型肝炎患者外周血Th17/Treg和Th1免疫失衡研究

目的：探讨Th17、Treg和Th1细胞免疫失衡在慢性乙型肝炎（CHB）发病中的作用。方法：采用荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMCs）中Th17、Treg和Th1细胞的特异性转录因子RORC、Foxp3和T-bet的mRNA表达,ELISA分析CHB患者PBMCs培养上清液中白细胞介素（IL）-17、IL-21和血清IL-6、IL-1β的水平,PCR检测外周血HBV DNA;生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）。结果：与正常对照组相比,CHB患者PBMCs中RORC mRNA、IL-17、IL-21水平明显升高（P〈0.01）;RORC mRNA与ALT呈正相关,与T-bet mRNA呈负相关;T-betmRNA与ALT呈负相关,外周血中IL-6、IL-1β水平也明显增高（P〈0.01）;Foxp3 mRNA与HBV DNA正相关。结论：Th17和Treg、Th1细胞免疫功能失衡与CHB病情密切相关。     

山茶油对哮喘患儿外周血单个核细胞GATA-3表达和IL-4分泌的影响

目的探讨山茶油对哮喘患儿外周血单个核细胞（PBMCs）转录因子GATA结合蛋白3（GATA-3）表达和白细胞介素-4（IL-4）分泌的影响。方法采用密度梯度离心法分离哮喘患儿肝素化血液中的PBMCs，以10、50、100、200 μmol/L的山茶油处理PBMCs 24 h。MTT法检测山茶油对PBMCs活性的影响；ELISA检测山茶油对PBMCs IL-4分泌的影响；实时荧光定量PCR检测山茶油处理PBMCs后GATA-3 mRNA和IL-4 mRNA的表达水平；Western blotting检测山茶油处理PBMCs中GATA-3蛋白表达水平。结果与对照组比较，10、50、100 μmol/L山茶油对PBMCs活力无明显影响（P>0.05），200 μmol/L山茶油能明显降低PBMCs活力（P < 0.01）；不同浓度山茶油处理PBMCs后，IL-4分泌水平均明显降低（P < 0.01），当山茶油浓度为50 μmol/L时，IL-4分泌水平最低（P < 0.01）；不同浓度山茶油处理PBMCs后，GATA-3 mRNA和IL-4 mRNA的表达均被明显抑制（P < 0.05），当山茶油浓度为50 μmol/L时，GATA-3与IL-4的mRNA表达量最低（P < 0.05）；不同浓度山油茶处理PBMCs后GATA-3蛋白表达均降低（P < 0.05），当山茶油浓度为10 μmol/L时，GATA-3蛋白的表达量达到最低水平（P < 0.05）。结论山茶油可抑制哮喘患儿PBMCs中GATA-3表达及IL-4的分泌，对哮喘具有潜在的治疗作用。     

系统性红斑狼疮患者Th1／Th2相关转录因子的基因表达

目的：探讨转录因子对T细胞分化的影响及它们和细胞因子在系统性红斑狼疮（SEE）发病机制中的作用。方法：利用实时荧光定量PCR技术检测SLE患者、正常人外周血单核细胞（PBMC）中T—bet和GATA-3 mRNA表达状况;用ELISA检测SLE患者、正常人血清中IL-10和TGF-β水平。结果：SLE患者T—bet mRNA表达低于正常人,差异具有显著性（P〈0．05）;SLE患者GATA-3mRNA表达明显高于正常人,具有统计学差异（P〈0．05）。SLE患者IL-10明显高于正常人,差异具有统计学意义（P〈0．05）;SLE患者TGF-8与正常人差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：SLE患者Th1／Th2免疫不平衡占优势,调节Th1细胞的转录因子T—bet表达降低。调节Th2细胞的转录因子GATA-3表达升高,细胞因子IL-10水平升高,TGF—β没有明显变化。     

miR-26a-5p影响肝癌细胞迁移和侵袭的机制研究

目的探讨微小RNA-26a-5p（miR-26a-5p）对腹水来源的高转移人肝癌细胞系SK-HEP-1生物学行为的影响及机制。方法采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测比较人正常肝细胞LO2及不同人肝癌细胞系（HepG2、BEL-7402、SMMC-7721、MHCC97H和SK-HEP-1）中miR-26a-5p和IL-6mRNA的表达水平。选择低表达水平的SK-HEP-1细胞转染miR-26a-5p模拟物,采用qRT-PCR法和ELISA法检测转染后细胞中miR-26a-5p、IL-6mRNA的表达水平和IL-6的分泌情况。划痕和Transwell实验检测miR-26a-5p对SK-HEP-1细胞转移和侵袭能力的影响。双荧光素酶报告基因检测miR-26a-5p与IL-63''-非编码区（UTR）的靶向结合关系。Westernblot法检测miR-26a-5p对SK-HEP-1细胞中信号转导和转录激活因子3（STAT3）蛋白磷酸化和上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达变化。采用qRT-PCR法检测miR-26a-5p对EMT相关基因表达水平的影响。结果与LO2相比,人肝癌细胞中miR-26a-5p相对表达量明显下调,IL-6mRNA相对表达量明显上调,其中SK-HEP-1中相对表达量差异最为显著。miR-26a-5p模拟物转染SK-HEP-1细胞后,miR-26a-5p相对表达量显著增高,IL-6mRNA和蛋白相对表达量显著下调。双荧光素酶报告基因实验证实miR-26a-5p与IL-63''-UTR存在序列特异性靶向结合关系。与空白对照组和模拟物对照组相比,miR-26a-5p模拟物明显抑制SK-HEP-1细胞迁移和侵袭的能力,同时显著降低IL-6下游信号STAT3蛋白的磷酸化水平,升高E-钙黏蛋白相对表达量和降低波形蛋白相对表达量。与模拟物对照组相比,miR-26a-5p模拟物显著改变EMT相关基因表达。结论miR-26a-5p通过靶向抑制IL-6mRNA,下调STAT3磷酸化,调控肝癌EMT标志物的基因和蛋白水平的表达,从而逆转肝癌细胞SK-HEP-1迁移和侵袭。     

成人微小病变肾病患者外周血CD4+Foxp3+调节性T细胞的研究

目的 研究CD4+Foxp3+调节性T细胞（CD4+Foxp3+Treg）及亚群在成人微小病变肾病（MCD）患者外周血CD4+T细胞中的分布,探讨CD4+Foxp3+Treg参与MCD发病的可能机制。方法 以27例经肾穿刺活检确诊为MCD的初发成人患者作为研究对象,采用Foxp3-FITC/CD45RA-PE/CD3-ECD/CD4-PC7抗体组合经流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4+Foxp3+Treg及亚群占CD4+T细胞的百分比。Real-Time PCR检测PBMCs中Foxp3、Th17转录因子RORc以及细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-17A 、IL-23 mRNA表达。设立正常对照。结果 流式细胞检测显示CD4+Foxp3+Treg分成3个细胞群体,分别为CD45RA+Foxp3low(Ⅰ区,静息期Treg)、CD45RA-Foxp3high（Ⅱ区,活化Treg)和CD45RA-Foxp3low(Ⅲ区)。MCD组Ⅰ区+Ⅱ区细胞和Ⅱ区细胞占CD4+T细胞的百分比显著低于对照组（P<0.01）。MCD组PBMCs中Foxp3 mRNA表达较对照组下调（P<0.05）,RORc mRNA表达较对照组上调（P<0.05）,IL-6、IL-17A、IL-23 mRNA表达均显著高于对照组（P<0.05和P<0.01）。相关性分析显示,MCD组IL-17A mRNA表达与Ⅱ区细胞占CD4+T细胞的百分比呈显著负相关（r=－0.81,P<0.05）。结论 成人MCD患者外周血Treg及其活化功能亚群减少,同时伴有Th17转录基因及其相关细胞因子表达的异常升高。提示Treg Foxp3 mRNA表达下调及Treg/Th17细胞比例失衡可能与MCD的发病有关。     

循环型microRNA-26a及其靶基因PTEN与系统性红斑狼疮的相关性研究

目的探讨循环型microRNA-26a（miR-26a）及靶基因PTEN在系统性红斑狼疮（SLE）的表达,以及在SLE发生、发展中可能发挥的作用。方法选取36例SLE和10例健康体检者血液标本,实时荧光定量聚合酶链反应检测血清miR-26a、外周血单个核细胞（PBMC）中PTEN 的表达,统计分析miR-26a、PTEN 与SLE临床资料的相关性,利用双荧光素酶报告系统验证PTEN是否为miR-26a 的靶基因。结果SLE 患者血清miR-26a mRNA 的表达高于健康人群（P <0.05）,PBMC 中PTEN mRNA 的表达低于健康人群（P <0.05）。SLE 患者miR-26a、PTEN 的表达水平与C3、抗ds-DNA、红细胞沉降率、狼疮活动指数相关。miR-26a 转染BaF3 细胞后,PTEN 表达下调,PI3K 表达上调,转染组荧光素酶活性下降（P <0.05）。结论SLE 患者血清中过表达的miR-26a可能通过下调靶基因PTEN,上调PI3K/AKT信号通路,参与SLE的发生、发展。     

阿托伐他汀对巨噬细胞ABCA1表达的影响

目的观察阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）表达的影响。方法THP-1细胞经160 nmol/L佛波酯（PMA）孵育24 h,诱导分化成巨噬细胞,分别与不同浓度的阿托伐他汀（0、1、10、100μmol/L）作用不同时间（0 h、6 h、12 h、24 h）。提取各组细胞总RNA和蛋白质,分别采用RT-PCR和W esternB lot检测ABCA1的mRNA和蛋白的表达。结果与对照组比较,不同浓度的阿托伐他汀与巨噬细胞孵育不同时间组的细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达无统计学差异（P〉0.05）。结论阿托伐他汀对巨噬细胞ABCA1的表达无影响。     

女性系统性红斑狼疮患者雌激素受体的表达

目的:检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中雌激素受体在基因和蛋白水平的表达,分析其表达类型与女性系统性红斑狼疮的相关性。方法:收集46例女性SLE患者和33例健康体检者空腹静脉血,分离PBMCs,采用RT-PCR法检测PBMCs中雌激素受体(estrogen receptor,ER)αmRNA、ERβmRNA的表达,荧光免疫技术检测ERα和ERβ在蛋白水平的表达。分析两组ER表达的差异。结果:SLE患者组PBMCs中ER亚型在基因和蛋白水平上的表达率与正常对照组无显著差异(P>0.05)。结论:ER的表达类型与女性SLE没有相关性。     

SOCS超甲基化在经典型慢性骨髓增殖性肿瘤发病中的作用研究

目的探讨细胞因子信号传导抑制蛋白（SOCS）基因超甲基化在经典型慢性骨髓增殖性肿瘤（MPN）发病机制中的作用。方法采用甲基化特异性PCR法检测220例MPN患者骨髓标本中SOCS1、SOCS3基因启动子区CpG岛甲基化发生情况,直接测序法检测MPN患者JAK2V617F、MPLW515L/K基因突变情况。应用粒细胞集落刺激因子化学诱导MPN细胞生长不同时间后,采用实时定量PCR和蛋白印迹法检测SOCS1、SOCS3 mRNA及其蛋白表达情况。同时,加入去甲基化试剂培养MPN细胞不同时间后,实时定量PCR法检测SOCS1、SOCS3 mRNA表达情况。结果 MPN患者中44例（20.0%）存在SOCS1基因超甲基化,90例（40.9%）存在SOCS3基因超甲基化,156例（70.9%）JAK2V617F突变阳性,3例JAK2V617F未突变的原发性血小板增多症患者检测到MPLW515突变（其中2例为MPLW515L,1例为MPLW515K）,2例JAK2V617F未突变原发性骨髓纤维化患者检测到MPLW515L突变;SOCS1、SOCS3基因超甲基化组与未甲基化组相比,其SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白表达量明显减少（P＜0.05）;JAK2V617突变组与无突变组相比,其SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白表达量明显减少（P＜0.05）;SOCS1、SOCS3基因超甲基化组,加入去甲基化试剂后SOCS1、SOCS3 mRNA表达量明显升高（P＜0.05）。结论 MPN患者中存在高频率的JAK2V617F基因突变和低频率的MPL基因突变以及SOCS基因启动子区CpG岛超甲基化;SOCS超甲基化和JAK2V617F突变导致SOCSmRNA和蛋白表达水平降低,异常激活JAK/STAT信号传导通路,引起细胞代谢失常而最终影响MPN的发生、发展;SOCS超甲基化是一种潜在的MPN诊断生物分子标志物及治疗靶标。     

宫颈癌组织中IDO表达与外周血中T细胞亚群的相关性研究

【目的】探讨宫颈癌组织中IDD基因表达量与患者外周血中T淋巴细胞亚群数量的相关性。【方法】选择2010年1月-2012年1月期间我院符合纳入及排除标准的CINIII患者20例;宫颈癌患者20例;健康妇女20例。半定量RT-PCR、Western blotting检测宫颈组织中IDO mRNA及蛋白表达;流式细胞仪检测外周血中CD4＋T细胞、CD8＋T细胞、CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs数量。【结果】宫颈浸润癌、宫颈原位癌组织中IDO mRNA及蛋白表达高于正常宫颈组织（P〈0.001）。宫颈浸润癌患者外周血中CD3＋T细胞、CD4＋T细胞、CD8＋T细胞数量及CD4＋/CD8＋显著降低,CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs数量显著增高（P〈0.05）。宫颈癌组IDO mRNA表达及蛋白表达与CD3＋T细胞,CD4＋T细胞/CD8＋T细胞呈负相关;与CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs呈正相关【结论】宫颈癌组织中IDO表达增高,机体免疫功能降低,IDO表达与肿瘤免疫抑制有关。     

三氧化二砷对人胃癌MGC803细胞FOX03a和VEGF表达的影响

目的观察FOXO3a基因沉默后,三氧二砷（As2O3）对人胃癌MGC803细胞FOX03a和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用脂质体转染小干扰RNA（siRNA）方法降低胃癌MGC803细胞FOX03a的表达。采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测FOX03a和VEGF mRNA的表达;采用Western blot法检测FOX03a和VEGF蛋白的表达。结果与对照组相比,As2O3促进胃癌MGC803细胞内FOX03a蛋白和mRNA的表达,并抑制VEGF蛋白和mRNA的表达,FOXO3 asiRNA处理后明显抑制FOX03a蛋白与mRNA表达且增加VEGF蛋白和mRNA表达。结论As2O3可能是通过促进MGC803细胞中FOXO3a的表达引起VEGF表达的降低。     

三氧化二砷对系统性红斑狼疮患者Toll样受体9及α-干扰素的影响

目的:了解三氧化二砷(AS2O3)对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)Toll样受体9(TLR9)mRNA 及α-干扰素(IFN-α)表达的影响,为阐明AS2O3治疗SLE的作用机制提供依据.方法:SLE患者和正常人PBMCs分别与环磷酰胺(CTX)及不同浓度AS2O3进行体外培养12h和24h...     

NMDA受体亚单位NR1在离体人神经干细胞中的表达

目的研究离体培养的人海马神经干细胞（NSCs）中NMDA受体亚单位NR1的表达。方法分离培养胎龄8-12周人胚脑海马神经干细胞,对NSCs进行Nestin和分化鉴定。用免疫细胞化学、Western blot免疫印迹和RT—PCR等方法检测原代、传代1次、传代2次的人胚胎海马NSCs中NR1蛋白和mRNA的表达。结果在孕8～12周人胚脑海马分离培养的NSCs中,NMDA受体亚单位NRI免疫细胞化学反应呈阳性,该受体亚单位的蛋白和mRNA均被检测钊。结论体外培养的早期人胚胎海马NSCs能稳定表达NMDA受体亚单位NR1。     

BORIS通过表观修饰对人肝癌细胞SOCS3表达的调控

目的 探讨人肝癌细胞系中印记位点结合因子（BORIS）对细胞因子信号传导抑制因子-3（SOCS3）表达的调控方式。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测SOCS3 mRNA在肝癌细胞中的表达;Western blot检测敲低和过表达BORIS的肝癌细胞中SOCS3蛋白的表达;在敲低和过表达BORIS的肝癌细胞系中使用甲基化特异性PCR（MSP-PCR）,检测SOCS3基因启动子区域甲基化状态;通过UCSC数据库分析,找到SOCS3基因启动子区潜在的BORIS结合位点,使用染色质免疫共沉淀（ChIP）-实时定量PCR（ChIP-qPCR）探索内源性高表达BORIS细胞中BORIS在SOCS3启动子区的富集状况;通过ChIP-qPCR检测敲低和过表达BORIS对SOCS3启动子区组蛋白甲基化状态。结果 在肝癌细胞中SOCS3 mRNA表达较高,在敲低或过表达BORIS mRNA肝癌细胞中,SOCS3蛋白表达相应下调或上调,即在肝癌细胞中BORIS以正向调控的方式调控SOCS3蛋白质的表达;MSP-PCR实验显示在SMMC-7721和HepG2细胞SOCS3启动子为非甲基化,敲低BORIS不改变甲基化状态,Huh7细胞的SOCS3启动子区为甲基化状态,过表达BORIS后,SOCS3启动子区转变为非甲基化状态,但在HCCLM3中SOCS3启动子为非甲基化,过表达BORIS不影响甲基化状态;ChIP-qPCR表明在内源性高表达BORIS的细胞中,BORIS特异性结合在SOCS3启动子区;组蛋白甲基化检测结果表明,敲低BORIS减少了BORIS在SOCS3启动子区富集,同时减少该区域H3K4 me2,增加H3K27 me3,而在过表达BORIS的细胞中呈现相反的结果。 结论 BORIS作为一个表观遗传调控因子调控SOCS3基因启动子区的甲基化状态和组蛋白甲基化修饰,影响SOCS3的表达,进而参与肝癌发生发展的过程。