Pax5基因与血液系统肿瘤

Pax5基因在人类肿瘤尤其是血液系统肿瘤中存在染色体易位、基因重排、异常高频突变、启动子异常甲基化等形式的异常表达。了解Pax5基因在B-NHL、MM、B-ALL等血液系统恶性肿瘤中的异常表达情况对于认识血液恶性肿瘤的致病机制以及研究Pax5在诊断分期和治疗监测的临床应用价值具有重要意义。     

流式细胞术分析户尘螨致敏的嗜碱性粒细胞活化试验及其临床意义

目的建立流式细胞术(FCM)分析嗜碱性粒细胞活化试验(BAT)的方法并评估其在过敏性疾病诊断中的意义。方法以CD63/CD203c/CD45抗体组合,建立用FCM分析户尘螨致敏的嗜碱性粒细胞脱颗粒的方法。以皮肤点刺试验(SPT)作为金标准方法,将FCM检测活化嗜碱性粒细胞与荧光酶联免疫吸附试验(FELISA)测定特异性IgE(sIgE)结果作比较,分析其临床应用价值。结果以CD45和CD203c联合设门,可以得到纯的嗜碱性粒细胞;CD63是活化嗜碱性粒细胞的最佳标志;Spearman相关系数显示,sIgE的Unicap分级与活化嗜碱性粒细胞呈中度相关;FCM检测活化嗜碱性粒细胞与FELISA测定sIgE结果在户尘螨过敏性疾病诊断中的差异无统计学意义(P>0.05),但前者的敏感度、符合率、阳性预测值以及阳性似然比各项指标都优于后者。结论通过FCM分析CD63的表达来确定活化嗜碱性粒细胞是诊断速发型超敏反应的一种有效、安全的体外检测方法。     

儿童急性白血病细胞视网膜母细胞瘤蛋白的表达及临床意义

本研究检测视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）在不同类型儿童急性白血病细胞中的表达，并探讨其表达水平与细胞周期、危险度、微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测、预后等临床诊断治疗监测指标的关系。对89例初发小儿急性白血病患者（包括25例AML，10例T-ALL，54例B-ALL）及7例正常对照骨髓标本，采用流式细胞术（FCM）分别检测治疗前后视网膜母细胞瘤蛋白的表达情况．并对部分病例进行细胞周期分析。结果表明：①流式细胞术检测pRb的表达准确直观；②在各种类型的急性白血病中pRb的高水平表达具有普遍性，同一患儿白血病细胞pRb的表达明显高于非白血病细胞，在不同类型的急性白血病中pRb均有缺失表达；③pRb的表达水平与白血病细胞的细胞循环周期可能存在一定的相关性，pRb表达阳性的B-ALL中处于G1期的白血病细胞数显著高于pRb表达阴性的病例（92％ vs 77％）；④B-ALL中，MRD阳性组pRb的表达量明显低于阴性组，且差值有统计学意义（P〈0．05），并且治疗前后非白血病细胞的pRb表达水平是稳定的；⑤pRb的表达量与B—ALL早期治疗预后之间存在一定相关性，B-ALL预后不良组pRb的表达量低于预后良好组（P〈0．05）。结论：pRb在儿童急性白血病细胞中存在高水平表达或缺失等异常形式的表达差异，pRb的表达与白血病细胞的细胞周期、MRD监测、早期治疗反应的预后评价等存在相关性，对于B-ALL的治疗监测及预后评估具有指导意义。     

胃癌CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞的异常增高与患者免疫抑制状态的相关性分析

目的:探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞在胃癌患者血清及腹腔冲洗液(或积液)中异常增高与机体免疫状态的关系。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胃癌患者血清和腹腔冲洗液中IFN-γ、IL-4细胞因子的水平。利用多参数流式细胞仪分析56例胃癌患者术前的外周血和肿瘤组织浸润淋巴细胞(TIL)中Treg细胞及CD8+T细胞[又称细胞毒T淋巴细胞(CTL)]的比率。另检测12例胃癌患者手术前后外周血Treg细胞的比率变化。结果:相对于健康对照组,胃癌患者血清Th1/Th2比例降低,差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌患者外周血中的Treg细胞比率明显高于健康对照组,晚期患者高于早期患者,差异有统计学意义(P均<0.05);TIL中Treg比率明显高于外周血(P<0.05)。12例患者肿瘤切除后Treg细胞比率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:胃癌患者血清及肿瘤组织中Treg细胞的比率随肿瘤进展而升高;Treg细胞比率升高和CTL降低可能参与肿瘤细胞的免疫逃逸。     

成人微小病变肾病患者外周血CD4~＋Foxp3~＋调节性T细胞的研究

目的研究CD4＋Foxp3＋调节性T细胞（CD4＋Foxp3＋Treg）及亚群在成人微小病变肾病（MCD）患者外周血CD4＋T细胞中的分布,探讨CD4＋Foxp3＋Treg参与MCD发病的可能机制。方法以27例经肾穿刺活检确诊为MCD的初发成人患者作为研究对象,采用Foxp3-FITC/CD45RA-PE/CD3-ECD/CD4-PC7抗体组合经流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4＋Foxp3＋Treg及亚群占CD4＋T细胞的百分比。Real-Time PCR检测PBMCs中Foxp3、Th17转录因子RORc以及细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达。设立正常对照。结果流式细胞检测显示CD4＋Foxp3＋Treg分成3个细胞群体,分别为CD45RA＋Foxp3low（Ⅰ区,静息期Treg）、CD45RA-Foxp3high（Ⅱ区,活化Treg）和CD45RA-Foxp3low（Ⅲ区）。MCD组Ⅰ区＋Ⅱ区细胞和Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比显著低于对照组（P〈0.01）。MCD组PBMCs中Foxp3mRNA表达较对照组下调（P〈0.05）,RORcmRNA表达较对照组上调（P〈0.05）,IL-6、IL-17A、IL-23mRNA表达均显著高于对照组（P〈0.05和P〈0.01）。相关性分析显示,MCD组IL-17A mRNA表达与Ⅱ区细胞占CD4＋T细胞的百分比呈显著负相关（r=-0.81,P〈0.05）。结论成人MCD患者外周血Treg及其活化功能亚群减少,同时伴有Th17转录基因及其相关细胞因子表达的异常升高。提示Treg Foxp3 mRNA表达下调及Treg/Th17细胞比例失衡可能与MCD的发病有关。     

应用实时荧光定量PCR检测母血浆胎儿DNA进行RhD基因型产前诊断

目的建立实时荧光定量PCR(real time PCR)技术检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿RhD基因型的方法。方法通过微量DNA抽提技术提取母血浆中胎儿游离DNA,利用Real time PCR检测22例妊娠15～40周的单胎RhD阴性孕妇血浆中胎儿游离DNA,进行男性性别决定基因(SRY)和RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,基因型结果与血清学RhD定型结果对比,评价该技术方法的准确性。结果孕妇血浆中存在游离胎儿DNA。19例RhD真阴性孕妇血浆中,14例均检测到胎儿游离DNA的RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,判断为RhD阳性,基因定型结果与血清学表型相符。3例未检测到胎儿游离DNA的RhD基因特异性扩增,结果与胎儿血清学表型相符。因此检测胎儿游离DNA的RhD基因型准确率达到89.5%。另外2例只检测到RhD基因外显子10扩增,通过新生儿脐血血清学吸收放散试验确定为RhDel型。3例RhDel型孕妇血浆中检测到RhD基因扩增,不适于胎儿RhD基因型的分型。结论实时荧光定量PCR方法检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性诊断胎儿RhD基因型...     

CD+4CD+25CDlow/-127细胞体外抑制效应T淋巴细胞增殖的影响

1995年,Sakaguchi等 [1]率先在小鼠外周血中分离获得发挥免疫抑制功能的CD+4CD+25T淋巴细胞,被称为调节性T淋巴细胞(Regulatory T cells,Treg).Treg细胞不仅具有抑制自体反应性T淋巴细胞的功能,还能阻止效应性T淋巴细胞的过度增殖和活化,甚至能影响B淋巴细胞产生免疫球蛋白 [2].因此,对Treg细胞的功能研究正成为当今国内外的研究热点.本研究以CD+4CD+25CDlow-127为膜表面标志分选Treg细胞,利用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diaeetate,succinimidyl ester,CFSE)方法 体外检测其对效应T淋巴细胞增殖的影响,从而为Treg细胞的功能研究奠定实验基础.     

RNAi阻断pax5基因的表达对B系恶性淋巴瘤细胞生物学特性的影响

本研究目的在于了解pax5基因对B系血液肿瘤细胞的免疫表型、细胞增殖及凋亡等生物学特性的影响。应用体外转录RNAi方法合成pax5特异的shRNA，用实时荧光定量PCR和Western blot技术评价基因沉默效果、筛选有效的shRNA，利用流式细胞术、MTT实验以及real—timePCR等技术检测沉默前后细胞免疫表型、增殖、凋亡等变化。结果表明：应用体外转录RNAi方法合成的shRNA抑制了B系恶性淋巴瘤细胞株中pax5在mRNA和蛋白水平的表达；pax5阻断表达后的淋巴瘤细胞免疫表型发生了变化，信号分子CD19的mRNA和蛋白表达水平均相应降低，而细胞膜表面分子IgM未发生明显改变；pax5的沉默表达对淋巴瘤细胞增殖效率和凋亡的影响无显著性差异（P〉0.05）．结论：pax5基因对B细胞的晚期分化起着重要作用，pax5基因可能参与淋巴瘤细胞的信号转导，未检测到pax5瞬时缺失表达对淋巴瘤细胞生长增殖及凋亡的影响，对其机制有必要进一步深入研究，     

转录因子PAX5在儿童急性白血病细胞中的表达

为了观察了解儿童急性白血病细胞中转录因子PAX5的表达特性，采用实时定量RT—PCR方法测定了6个血液肿瘤细胞株以及6例正常儿童、58例初发和4例复发急性白血病儿童（其中包括39例B—ALL，10例T—ALL和13例AML）骨髓细胞中PAX5和CD19mRNA的表达水平。结果表明：在Namalwa（B细胞系）细胞株中，PAX5和CD19mRNA相对表达量分别为2．35％和2．52％；而在T-和髓系细胞株中几乎不表达。在临床样本中B—ALL组比T—ALL组和AML组的PAX5mRNA表达高（P=0．029和P=0．013）。T—ALL组和AML组的PAX5mRNA表达水平均低于正常对照组，而T—ALL组与AML组之间的表达差异无显著意义。在B—ALL患儿中，PAX5mRNA表达的个体差异很大。此外还发现，初发治疗前组和复发组的B—ALL患儿PAX5mRNA表达高于化疗完全缓解组（P=0．011和P=0．006）。由于在CD19基因的启动子上有B细胞特异性激活蛋白的结合位点，研究发现在B-ALL中PAX5表达水平与同样用实时定量RT—PCR检测的CD19表达水平之间存在明显的相关性。结论：运用实时定量RT—PCR方法能快速准确地在B—ALL的临床标本中检测和定量PAX5基因的表达。研究中发现部分B—ALL中PAX5mRNA表达明显升高，因此它可将其作为进一步研究B—ALL发病机理的另一个切入点。