多种细胞移植治疗心肌梗死的比较

目的通过横向比较乳鼠心肌细胞、骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞及诱导后的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的疗效,确定更优异的移植细胞。方法分离培养和鉴定新生心肌细胞、骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞,并在体外用5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。二脒苯基吲哚(DAPI)标记移植细胞,5组(包括4组细胞处理组和对照组)大鼠急性心肌梗死后一周,可直视下在梗死中央区和周边区注射同等数量级细胞(2×106／只),4周后行心功能检测。处死动物,免疫荧光法检测移植细胞缝隙连接蛋白(connexin-43)、横纹肌肌动蛋白、血管平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅷ因子相关抗原(vWF)以确定移植细胞的分化情况,免疫组化法检测心肌组织中血管平滑肌肌动蛋白和vD因子相关抗原以确定血管新生情况。结果体外实验显示经5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞能部分表达横纹肌肌动蛋白:体内试验,移植4周后,间充质干细胞组、乳鼠心肌细胞组、骨髓单个核细胞组大鼠心功能均较对照组大鼠心功能明显提高,其中间充质干细胞组优于其他处理组,间充质干细胞,能表达血管平滑肌肌动蛋白,促进血管新生,但未见其表达心肌细胞特异抗原,而诱导后骨髓间充质干细胞对心功能无显著作用。结论在乳鼠心肌细胞、骨髓单个核细胞、骨髓间充质干细胞、诱导后的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠的急性心肌梗死的比较中,间充质干细胞对心功能的保护效果最显著,其机制与血管新生等有关。     

体内外诱导人脐血间充质干细胞向心肌细胞的定向分化

目的观察在体外5-氮胞苷诱导和体内心肌缺血微环境诱导下,人脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞的定向分化。方法收集健康产妇脐血细胞,采用密度梯度离心结合差速贴壁的方法分离MSCs,传代培养至第三代,应用流式细胞术分析MSCs表面分子CD34、CD45、CD44和CD90的表达。体外应用5-氮胞苷（5-aza）诱导MSCs四周后,免疫荧光染色和RT-PCR分别检测MSCs心肌标志物cTnT（肌钙蛋白）和Connexin43（缝隙连接蛋白）的表达;体内将GFP标记的MSCs移植入心肌梗死大鼠模型心肌梗死周边区,移植后1周,取大鼠心脏行冰冻切片,免疫荧光染色检测MSCs心肌特异性蛋白cTnT和Connex-in43的表达。结果分离的MSCs表达表面分子CD44和CD90,不表达CD34和CD45;MSCs体外经5-氮胞苷诱导后在mRNA和蛋白水平均表达心肌标志物cTnT和Connexin43;MSCs体内移植后1周,免疫荧光染色检测发现移植的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT和Connexin43。结论人脐血间充质干细胞可在体外诱导和体内心肌缺血微环境下向心肌细胞分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的困惑与争议

1999年Makino等[1]首次在体外应用5-氮胞杂苷（5-Aza）将骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells MSCs）定向分化成心肌细胞,为MSCs移植治疗心肌梗死提供了细胞生物学基础。2001年,Orlic等[2]将Lin-C-Kit＋干细胞注射到心肌梗死小鼠的存活心肌内,发现其分化为心肌样细胞,开创了干细胞在体内移植治疗心肌梗死的先河。然而,随着研究的不断深入,众多学者对MSCs能否分化为心肌细胞、其改善心功能机制等方面产生质疑,本文就干细胞移植治疗心肌梗死存在问题与争议综述如下。     

急性心肌梗死大鼠移植入人脐带血间充质干细胞后心肌组织检测

目的探讨经尾静脉脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植到急性心肌梗死大鼠体内,观察其是否可以存活及是否向心肌组织分化。方法无菌条件下采集健康育龄产妇正常分娩胎儿脐带血,通过Mesencult培养基条件培养,取P2代细胞用流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD45、CD105标志。将36只SD大鼠随机分成MSCs移植组、假手术组和心肌梗死植组各12只,结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌梗死模型。1周后,经尾静脉注射带DAPI标记的脐血MSCs。4周后行免疫组织化学检测移植细胞存活与分化情况及检测梗死组织中FactorⅧ表达来比较三组微血管密度。结果流式细胞仪检测第2代的脐血MSCs结果显示,P2代MSCs不表达或极弱表达CD34,CD45造血细胞标志,稳定地高表达CD29,CD105间充质细胞相关的表面抗原标记。这与骨髓MSCs的表面抗原标志相一致。移植后4周,移植组心肌组织中可以观察到DAPI标记细胞存在,但标记细胞并未表达Troponin-T及connexin43,免疫组化染色检测示MSCs移植组心肌微血管密度(MVD)明显高于心梗组和假手术组。结论将脐血单个核细胞接种在mesencult培养基中可以在体外成功的培养出较纯化的脐血MSCs,脐血MSCs的免疫表型符合间充质干细胞特征,脐血MSCs移植能刺激梗死部位血管生成,但未向心肌细胞分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

【目的】探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的潜能。【方法】取大鼠下肢骨骨髓，分离培养MSCs，用5-氮胞苷(5-aza)定向诱导24h，相差显微镜下观察其形态变化，免疫组化法检测肌钙蛋白(cTnT)和心肌细胞结蛋白(desmin)表达，并通过RT-PCR对肌球蛋白重链(MHC)在细胞中的表达进行鉴定。【结果】MSCs经5-aza诱导后，部分细胞呈梭形，并可见肌管样结构。免疫组化检测示诱导后MSCs的cTnT阳性细胞数为15％，Desmin表达强阳性，RT—PCR示诱导后MSCs有MHC表达。【结论】MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞，是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的体外培养并诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学的方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果诱导后细胞体积较诱导前增大,而且更加细长,呈长梭形。14d细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin,α-SarcomericActin和心肌特异性cTnI呈阳性反应。结论MSCs可能具有表达心肌细胞的特异性启动或分化调控基因,5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

不同方法诱导的骨髓间充质干细胞移植修复大鼠梗死心肌

目的 探讨将不同方法诱导的骨髓间充质干细胞（MSCs）移植到心肌梗死部位后对梗死心肌的修复作用。方法 自成年大鼠骨髓中分离MSCs，分别以下列方式诱导：A组，用心肌细胞裂解液培养7d后移植；B组，MSCs与心肌细胞按1：4的比例共同培养7d后移植；C组，用5-氮杂胞苷（10μmol／L）诱导24h后，换DMEM培养液培养21d后移植；D组（对照组），用DMEM培养液培养21d后移植。建立大鼠心肌梗死模型，将上述4组MSCs进行DAPI标记后移植于梗死部位。用超声心动图检测移植前和移植30d后心肌功能的改变，苏木精-伊红染色观察移植细胞形态。结果 A、B组移植后大鼠左室舒张末期内径（LVEDD）和收缩末期内径（LVESD）比移植前减小，A、B、C组左室收缩功能指标射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）明显比移植前改善。D组移植前后大鼠各指标差异无显著性意义。A、B组移植后镜下可见DAPI标记的MSCs表现为成熟细胞形态，排列在残存的宿主心肌细胞之间，具备与宿主心肌细胞相似排列方向和形态学的特征。C、D组移植后镜下也可见到DAPI标记的细胞，但与宿主心肌细胞形态不同，小部分为成熟心肌细胞形态，大部分为成纤维细胞形态。结论 用与心肌细胞共培养和用心肌细胞裂解液培养两种方法诱导的MSCs移植于心肌梗死部位后，分化为心肌样细胞的效率高，模型鼠心功能恢复显著。     

骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

目的:探讨骨髓间质干细胞(MsCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料.方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达.结论:MsCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞.     

脐血MSCs移植对心肌梗死区旁残存心肌组织的影响

目的研究脐血间充质干细胞(MSCs)移植对心肌梗死区域旁残存心肌组织的影响。方法自孕犬脐血中分离、培养MSCs,经Laz基因转染和5-氮胞苷体外肌源性诱导后移植入犬急性心肌梗死模型(移植组,n=18)。分别于移植后1、4、8周处死动物,取心肌组织标本行TUNEL染色观察残存细胞凋亡情况并计算凋亡指数;应用激光共聚焦扫描显微镜图像分析系统检测残存心肌细胞体积;Nagar-Olsen染色观察心肌胶原网络的变化。以等量生理盐水注射作为移植对照组(n=18)。结果与对照组比较,移植组缺血区部各时间点切片位观察到凋亡细胞数目显著减少,凋亡指数明显降低;残存心肌细胞肥大明显;移植后第8周,心肌组织内胶原纤维排列整齐、规律。结论脐血MSCs移植可通过减少心肌细胞凋亡、促使残存心肌细胞肥大、调节心肌胶原网络而改善心功能。     

脐血间质干细胞移植后梗死心肌细胞的凋亡及意义

目的探讨脐血间质干细胞移植对梗死心肌残存心肌细胞凋亡的影响。方法无菌条件下采集成年杂种妊娠犬脐血,体外分离、纯化、培养、扩增脐血间质干细胞,经5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导向肌源性细胞分化,DAPI荧光标记,经左冠状动脉前降支灌注移植入成年杂种犬急性心肌梗死模型区域,2、4、8周取心肌标本,采用HE染色及TUNEL法检测犬心肌梗死模型中脐血间质干细胞移植后心肌细胞的凋亡情况。结果免疫组化法检测结果表明,培养的细胞为脐血间质干细胞,在5-aza诱导作用下可向肌源性细胞定向分化,2、4、8周后在移植区域观察到带荧光的心肌纤维和细胞核,排列方向与残留心肌组织基本一致,荧光标记的肌纤维相互连接。经TUNEL法检测可见在脐血间质干细胞移植组和对照组心肌梗死区域均有凋亡的心肌细胞分布,但移植组凋亡细胞明显低于非移植组;HE染色有相似的阳性率,阳性细胞多具有凋亡的形态特征。结论脐血间质干细胞移植梗死心肌除能形成心肌再生外,尚能减少心肌梗死后梗死区域的心肌细胞凋亡,达到延缓心室重构的目的。应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡有较强的实用性。     

间充质干细胞实现心肌修复:机遇与挑战

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类存在多种组织内的成体干细胞,主要来源于骨髓、脂肪组织和脐带血。随着对MSCs分离、培养、鉴定的程序化、标准化,使其成为实现心肌修复的理想种子细胞。MSCs植入受损心肌后可分泌多种生物活性物质,抑制心肌重构、促进新生血管形成。然而MSCs体内存活时间短、有形成肿瘤风险,使其尚未大规模应用于临床。为提高MSCs的治疗潜能、保障其治疗安全,基因修饰、药物诱导、生物工程等多种方法从基础走向了临床,使MSCs成为实现心肌修复的优质资源,为心肌梗死、终末阶段心力衰竭带来新的曙光。     

经冠状动脉移植同种异体脐带间充质干细胞治疗猪心肌梗死的实验研究

目的：探讨经冠状动脉移植同种异体脐带间充质干细胞治疗急性心肌梗死（AMI）的可行性及疗效。方法采用经皮球囊封堵法制备 AMI 模型,AMI 后2周将 GFP 标记的脐带间充质干细胞经冠状动脉移植入小型猪心肌梗死区域（移植组）,对照组注射等量生理盐水。分别于干细胞移植前、移植后6周行心脏超声和核素门控心肌灌注显像检查,观察心肌灌注的改善及心功能的变化情况。取心肌梗死区组织作冰冻切片,vWF 免疫组织化学法染色观察梗死区毛细血管新生情况。结果（1）对照组：心肌梗死后8周和心肌梗死后2周比较,各项指标均无显著改善（P ＞0．05）。移植组：干细胞移植后6周左室射血分数、左室收缩期末内径、左室舒张末期内径、左室短轴缩短率及左室心肌梗死面积均较移植前有明显改善（P ＜0．05）。与对照组比较,移植组各项指标均明显改善（P ＜0．05）。（2）vWF 免疫组织化学法染色显示移植组新生毛细血管密度高于对照组。结论经冠状动脉移植的同种异体脐带间充质干细胞能够在梗死心肌内存活,增加梗死区血管新生,缩小梗死面积,改善心功能。     

脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的研究进展

人脐带间充质干细胞是一种从人脐带间质组织中分离出来的全能干细胞,具有自我更新、免疫缺陷和多向分化潜能。新近研究表明,人脐带间充质干细胞在体内微环境及体外细胞因子的作用下不仅能够分化为胰岛样细胞,而且具有一定的β细胞分泌功能,能够降低血糖,克服了胰岛移植治疗糖尿病所面临的供体细胞缺乏和免疫排斥反应问题,从而有望为临床糖尿病细胞治疗开辟了一条新的途径。     

脐血MSCs移植对急性心肌梗死大鼠心肌的修复作用

目的:观察体内心肌缺血微环境诱导下人脐血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCBMSCs)向心肌样细胞的定向分化及对急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)大鼠心功能、新生血管的影响。方法:收集健康产妇脐血细胞,采用密度梯度离心结合差速贴壁的方法分离MSCs;健康成年SD大鼠30只,制备成AMI大鼠模型后分为2组,移植组在心肌梗死周边区注射移植GFP标记的UCBMSCs;对照组在心肌梗死周边区注射等量生理盐水。术后4周行超声心动图检测及血流动力学检查,并取心脏组织行冰冻切片,免疫荧光染色检测UCBMSCs心肌特异性蛋白cTnT和Connexin43的表达;并进行抗Ⅷ因子抗体免疫组化染色,观察心肌毛细血管密度(myocardial capillary density,MCD)的变化。结果:与对照组相比,术后4周移植的UCBMSCs表达心肌特异性蛋白cT-nT和Connexin43,对照组无心肌特异蛋白表达;移植组LVEDD、LVESD明显减小,而LVEF、LVFS明显增加,血流动力学指标明显改善;免疫组化染色结果显示,移植组梗死周边区MCD较对照组明显增加,移植组为(4.16±0.2)个/HP(×400),对照组为(2.29±0.3)个/HP,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:UCBMSCs移植可在大鼠AMI部位存活,并向心肌样细胞分化;UCBMSCs移植后明显改善AMI大鼠心功能及心室重构,促进毛细血管新生。     

移植的间充质干细胞与宿主心肌匹配整合实验研究

目的 探索间充质干细胞(MSCs)分化的心肌样细胞与宿主心肌匹配的解剖结构基础.方法 采用成年近交系Wistar大鼠,经左冠状动脉前降支结扎1 h建立心肌缺血再灌模型.术后1周,将来自同种供体、经体外扩增和Rt-GFP转染MSCs后植入梗死区.移植后4周测定心脏功能.随后取材、连续冰冻切片,观察心肌组织形态学的变化及MSCs分化的心肌样细胞缝隙连接(Connexin-43)的表达.结果 植入梗死区中的MSCs表达Connexin-43.移植组梗死区面积缩小,左心室壁厚度增加,心脏功能改善.结论 移植的MSCs通过分化为心肌样细胞,并与宿主心肌细胞形成电机械匹配结构即缝隙连接(Connexin-43),使新增加的心肌细胞能够与宿主心肌同步收缩,从而更有效改善心脏功能.     

经冠状动脉病变血管植入体外培养扩增的自体骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死区的疗效研究

目的 探讨经冠状动脉病变血管植入体外培养扩增的自体骨髓间充质干细胞(MSCs)对急性心肌梗死区的影响.方法 体外扩增培养巴马香猪MSCs.用球囊扩张封堵冠状动脉前降支制备巴马香猪急性心肌梗死模型,成模1个月后,经冠状动脉前降支植入体外扩增培养的自体MSCs至急性心肌梗死区,观察其对心肌梗死区的影响.结果 梯度离心法分离...     

经冠状动脉自体骨髓间充质干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死

目的评价经冠状动脉移植体外分离培养自体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死(AMI)的可行性及疗效.方法通过结扎冠状动脉左前降支90 min后恢复血流的方法建立AMI模型.采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞、传代培养后,在AMI造模10～14 d后将培养扩增的自体MSCs经冠状动脉植入梗死区,应用超声心动图观察移植前后心功能变化情况,冰冻切片荧光显微镜示踪4',6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记的MSCs,Ⅷ因子免疫荧光染色测定新生血管数目.结果MSCs生长呈纺锤样,生长旺盛呈旋涡样;DAPI标记率为l00%.AMI造模10～14 d后MSCs移植数量平均为(4～6)×107个,移植术后3个月,MSCs治疗组与对照组比较,左心室射血分数(LVEF)显著升高[(54.65±3.39)%vs(43.98±4.21)%(P＜0.01)],可见DAPI标记胞核为蓝色荧光的移植细胞,MSCs治疗组与对照组比较,新生血管数目显著升高[(13.28±4.39)vs(4.27 2.28)个,(P＜0.01)].结论通过体外培养扩增在短期内可以获得相当数量的生物性状稳定的MSCs,在AMI造模10～14 d后进行经冠状动脉MSCs自体移植,促进左室功能的恢复.MSCs移植与目前广泛运用的介入治疗相结合,方法简便、经济、有效,可望改善AMI患者的预后,具有良好的临床应用前景.