大鼠脊髓神经干细胞的体外培养及鉴定

目的:体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞,观察其生长、增殖和分化特点.方法:利用倒置显微镜、MTT法、免疫细胞化学等方法检测神经干细胞的增殖、分化情况.结果:分离的脊髓神经干细胞呵形成大量悬浮的神经球,并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈nestin阳性.在添加10%胎生血清7 d后,神经球细胞可分化为有神经元、星形胶质细胞特异性抗原表达的细胞.结论:体外培养大鼠胚胎脊髓可得到大量神经干细胞,并能分化为神经元和星形胶质细胞.     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定

目的分离培养新生SD大鼠神经干细胞,并对其生物学特性进行鉴定。方法采用无血清培养联合应用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对大鼠海马神经干细胞分离培养,采用免疫荧光的方法检测神经干细胞的nestin抗原。结果从新生大鼠海马齿状回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球,并且呈nestin阳性表达,具有多向分化能力。结论分离培养的细胞是中枢神经系统的干细胞。     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察

目的建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点.方法利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察.采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞.结果从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象.贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞.结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能.     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察

目的：建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点。方法：利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察。采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果：从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象。贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞。结论：用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能。     

新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化鉴定

目的：探讨分离、培养新生大鼠脊髓源性神经干细胞的方法并对其进行分化鉴定,为临床应用脊髓神经干细胞进行周围神经系统疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法：首次采用注射器灌注法分离新生24 h Wistar大鼠脊髓源性神经干细胞,神经细胞培养液调节细胞终浓度并进行培养,形成克隆后,传代。将传至第1代培养细胞加入含10%胎牛血清的DMEM /F12 培养基诱导其分化。形态学方法观察细胞的生长状态,利用鼠抗Nestin抗体、鼠抗GFAP抗体、鼠抗MAP-2抗体进行分化的神经干细胞免疫组织化学鉴定。 结果：新生大鼠脊髓源性神经干细胞可在体外培养条件下贴壁生长,在血清的作用下可分化为具有典型神经细胞形态、表达特异性组织蛋白Nestin、GFAP、MAP-2的神经细胞。结论： 大鼠脊髓内可分离出脊髓源性神经干细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力。     

体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞的增殖和分化

目的探讨大鼠胚胎脊髓神经干细胞的体外培养生长及分化情况,为神经干细胞的临床应用提供实验依据。方法取孕13d SD大鼠胚胎脊髓,在条件培养基中培养获得神经干细胞,应用免疫荧光法鉴定。神经干细胞在含血清的培养基中传代培养,应用免疫细胞化学法检测神经干细胞的分化情况。结果从大鼠胚胎脊髓可获得具有自我增殖分化能力的神经干细胞,培养7d即可获得神经球。用免疫细胞化学和免疫荧光法鉴定干细胞分化,可检测到神经元和星形胶质细胞。结论从大鼠胚胎脊髓能分离获得神经干细胞,并可向神经元和星形胶质细胞方向分化。     

神经球石蜡包埋和巢蛋白免疫组化染色

目的应用细胞团石蜡包埋技术,检测神经球内部的神经干细胞标记物巢蛋白(nestin)表达.方法从孕17 d的SD大鼠胚胎大脑海马部位分离,培养神经干细胞,石蜡包埋神经球,通过免疫组化方法检测神经球内部的nestin表达.结果培养中的神经球均显示nestin阳性表达,但阳性细胞比例和细胞团中阳性细胞所处部位有较大差异.结论细胞团石蜡包埋技术检测神经球内部的nestin表达,能全面反映神经球中神经干细胞存在的比例,可作为优化培养技术的实验基础.     

神经球石蜡包埋和巢蛋白免疫组化染色

目的应用细胞团石蜡包埋技术，检测神经球内部的神经干细胞标记物巢蛋白(nestin)表达。方法从孕17d的SD大鼠胚胎大脑海马部位分离，培养神经干细胞，石蜡包埋神经球，通过免疫组化方法检测神经球内部的nestin表达。结果培养中的神经球均显示nestin阳性表达，但阳性细胞比例和细胞团中阳性细胞所处部位有较大差异。结论细胞团石蜡包埋技术检测神经球内部的nestin表达，能全面反映神经球中神经干细胞存在的比例，可作为优化培养技术的实验基础。     

新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的体外研究

目的 探讨趋化因子受体CCR2在体外培养神经干细胞的表达.方法 采用无血清方法分离、培养新生大鼠海马神经干细胞,细胞免疫荧光方法检测神经干细胞标志巢蛋白(nestin)表达及干细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力,通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测神经干细胞表达趋化因子受体CCR2的情况.结果 体外培养新生大鼠海马神经干细胞呈nestin阳性,可分化为NF200阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞及CNP阳性少突胶质细胞,CCR2细胞免疫荧光及RT-PCR证实神经干细胞表达趋化因子受体CCR2.结论 新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR2,为进一步研究其体内、外迁移提供理论依据.     

Induction of functional recovery by co-transplantation of neural stem cells and Schwann cells in a rat spinal cord contusion injury model

Objective To study the transplantation efficacy of neural stem cells （NSCs） and Schwann cells （SC） in a rat model of spinal cord contusion injury. Methods Multipotent neural stem cells （NSCs） and Schwann cells were harvested from the spinal cords of embryonic rats at 16 days post coitus and sciatic nerves of newborn rats, respectively. The differential characteristics of NSCs in vitro induced by either serum-based culture or co-culture with SC were analyzed by immunofluorescence. NSCs and SCs were co-transplanted into adult rats having undergone spinal cord contusion at T9 level. The animals were weekly monitored using the Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating system to evaluate functional recovery from contusion-induced spinal cord injury. Migration and differentiation of transplanted NSCs were studied in tissue sections using immunohistochemical staining. Results Embryonic spinal cord-derived NSCs differentiated into a large number of oligodendrocytes in serum-based culture upon the withdrawal of mitogens. In cocultures with SCs, NSCs differentiated into neuron more readily. Rats with spinal cord contusion injury which had undergone transplantation of NSCs and SCs into the intraspinal cavity demonstrated a moderate improvement in motor functions. Conclusions SC may contribute to neuronal differentiation of NSCs in vitro and in vivo. Transplantation of NSCs and SCs into the affected area may be a feasible approach to promoting motor recovery in patients after spinal cord injury.     

神经干细胞在体外诱导向胆碱能神经元定向分化后移植治疗脊髓损伤

目的 研究神经干细胞向胆碱能神经元定向分化后对脊髓横断损伤的修复作用.方法 采用GFP转基因孕鼠(E 12～14d)的海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化.SD成年大鼠以显微剪横断脊髓制成SCI模型.将SD大鼠18只分为3组:A组注入DMEM/F12培养液;B组注入神经于细胞的细胞液,C组注入在体外定向诱导为胆碱能神经元的细胞液;3组实验动物均于细胞移植后采用B B B评分法定期评估运动功能.于移植后第8周末,取出相应的脊髓阶段,行ChAT免疫组织化学染色,光镜观察.结果 从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,胎鼠骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的11.8%分化成为胆碱能神经元,与对照组差异明显.B组和C组所有大鼠BBB评分在移植细胞3周以后明显高于A组(P＜0.05),C组所有大鼠BBB评分在移植细胞4周以后明显高于B组(P＜0.05).在移植第8周末,冰冻切片中可见ChAT染色阳性细胞.结论 神经干细胞可以在体外诱导向胆碱能神经元定向分化,定向分化后移植应用在脊髓横断损伤治疗中,可明显改善运动功能.     

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠半横断脊髓损伤

目的探讨WHBE兔用于热原检查试验适用性。方法按照《中国药典》2005年版中对热原检测的要求,对WHBE兔进行测温。结果WHBE兔筛选一次性合格率为74．91％,与日本大耳白兔相当,但略高于普通级新西兰兔,且WHBE兔初筛体温分布频率呈正态分布,以38．5-39．5℃居多,且体重大小对WHBE兔合格率影响不明显。结论WHBE兔体温稳定,重复性好,适合用于热原检查试验。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

大鼠脊髓来源神经干细胞NgR的表达

目的：检测大鼠脊髓来源神经干细胞Nogo-66受体（NgR）是否表达。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞，形成神经球后，以免疫荧光法鉴定神经干细胞并检测NgR的表达情况。结果：神经球及单个神经干细胞均显著表达NgR。结论：NgR在脊髓神经发育的干细胞阶段即开始表达。     

新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良

（1）目的：建立较理想的新生大鼠海马神经细胞体外原代培养方法。（2）方法：采用低浓度，长时间胰酶消化和机械分离相结合的方法进行单层原代培养。（3）结果：在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化，并能形成典型的神经细胞网络。（4）结论；该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法。     

少突胶质前体细胞分离培养方法的改进及其谱系限定细胞体外分化模型的建立

目的对少突胶质前体细胞(OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,并建立少突胶质谱系限制细胞的体外分化模型,以模拟体内OPCs的发育过程。方法通过非特异性差异黏附法与A2B5-IgM抗体免疫筛选法结合,从胚胎大鼠脊髓来源的细胞悬液中分离、纯化OPCs,用含成纤维细胞生长因子-2和血小板源性生长因子的培养液作扩增培养;再以三碘甲状腺氨酸和神经营养因子-3诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(OLs)。OPCs及其分化细胞的特性通过形态学观察和免疫化学染色法鉴定。结果 95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5;在一定的培养条件下,OPCs可持续扩增和反复传代,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性;进入分化进程的细胞将依次表达O4、O1、受体反应蛋白及髓鞘碱性蛋白等特异性分化抗原。结论分离的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与存在于胚胎脑区的O2A前体细胞(体内OPCs)相类似。     

胎鼠脊髓神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的:分离、培养和鉴定胎鼠脊髓神经干细胞,为建立稳定的脊髓神经干细胞系提供基础.方法:应用无血清培养技术从胎鼠脊髓分离、培养神经干细胞,并应用神经干细胞特异性抗体对其进行标记;应用BrdU掺入培养检测其分裂增殖能力;应用神经元和星形胶质细胞特异性抗体分析其多向分化潜能.结果:分离到的细胞具有不断分裂增殖的能力,可被神经干细胞特异性抗体所标记,并在血清条件下分裂为神经系统多种细胞.结论:分离到的细胞具有自我复制能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞,为应用于中枢神经系统损伤治疗提供了基础.