小鼠主动脉血管平滑肌细胞分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的技术方法并观察其生长特征。方法比较组织贴块法及酶联合消化法原代分离小鼠主动脉来源的VSMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态及免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法分别测定主动脉VSMC传代细胞的成活率、生长、增殖特征;观察不同血清含量对主动脉VSMC生长的影响。结果组织贴块法培养的细胞6 d后,细胞从组织块边缘长出,14 d后生长迅速可传代;酶联合消化法分离培养的细胞3 d后,细胞呈梭形生长,7～8 d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察可见呈典型"峰-谷"状生长;2种方法获得的细胞行免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率均为96%;细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示细胞生长第3～5天光密度值变化较明显;用含体积分数20%血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基高糖培养液培养的细胞出现明显对数期。结论本研究建立了高效分离和培养主动脉VSMC的2种方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型。     

组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织块贴壁法。方法采用组织块贴壁法进行原代培养,胰酶消化法传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90％的组织块接种存活,培养5代的平滑肌细胞纯度达98％以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷”状生长,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞操作简单、结果稳定、纯度较高、存活率高。     

SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养及鉴定

目的:研究SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RASMC)的培养方法及其生物学特性.方法:运用组织块贴壁法进行SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养,并用倒置相差显微镜观察、HE染色后形态学观察以及用免疫组化对培养细胞进行鉴定.结果:组织块贴壁法成功培养出SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,培养的细胞呈典型"峰-谷"样生长,HE染色细胞呈梭形,胞浆丰富,核大而圆或椭圆,免疫组化S-P法检测a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(a-SMActin)呈强阳性表达.传代纯化,细胞生长特性未见异常改变.结论:组织块贴壁法培养的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞生长稳定,培养和纯化可同步进行,简单,方便.     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的 体外分离培养兔血管平滑肌细胞(VSMC)并观察其生长特征.方法 采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力.结果 原代培养5 d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型"峰-谷"状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似"S"形;细胞生长第3～5 d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化最显著.结论 体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5 d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24 h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料.     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的体外分离培养兔血管平滑肌细胞（VSMC）并观察其生长特征。方法采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力。结果原代培养5d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型＂峰-谷＂状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似＂S＂形;细胞生长第3～5d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24h内划痕宽度变化最显著。结论体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料。     

人主动脉夹层血管平滑肌细胞的培养和鉴定

目的 建立人主动脉夹层(AD)血管平滑肌细胞(VSMC)体外培养的方法。 方法 以AD患者手术时切除的血管为原料,用组织块贴壁法进行VSMC的体外原代和传代培养,倒置显微镜观察细胞的生长情况,考马斯亮蓝染色、α-SMA及Ⅷ因子免疫荧光染色和透射电镜检测鉴定细胞。 结果 7～10 d原代细胞从组织块边缘迁移出来,3～4周细胞生长至融合,可进行传代。原代和传代的细胞生长良好,倒置显微镜下见细胞呈长梭形,有多个突起。细胞呈“峰谷状”生长,具有典型的VSMC特征。考马斯亮蓝染色和透射电镜下均可见细胞内有大量沿长轴生长的肌丝,α-SMA免疫荧光染色强阳性,Ⅷ因子免疫荧光染色阴性,证明所培养的细胞为VSMC。细胞传代至第6代以后开始出现老化现象。 结论 应用组织块贴壁培养的方法可成功地在体外培养人AD的VSMC,为今后研究AD的发病机制提供良好的实验基础。     

改良组织块贴壁法培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞及生物学鉴定?

目的：探讨小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的原代培养方法及生物学特性,为血管性疾病细胞及分子水平的科学研究提供实验材料。方法分离小鼠胸、腹主动脉,采用改良组织块贴壁法获得主动脉 VSMC,胰蛋白酶消化传代,差速贴壁法进行细胞纯化,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长情况,并用苏木素-伊红(HE)染色法和免疫荧光法进行鉴定。结果该方法成功分离出小鼠主动脉 VSMC,细胞生长旺盛,活性良好,呈放射状、典型“峰-谷”样生长,HE 染色细胞呈梭形,细胞质丰富,核大而圆形或椭圆形,细胞免疫荧光显示特异性的细胞质内α-平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论本方法简单、经济、可靠,可在体外条件下分离,培养出纯度高、活性良好的主动脉 VSMC。     

动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定

目的:介绍动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)原代培养及鉴定的方法。方法:分离载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉,组织贴块法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光及免疫组化方法检测细胞的纯度和分化状态。结果:培养第3天时,可见自组织块周围长出少量梭形或长梭形细胞,至培养2周细胞融合成片,呈"峰、谷"状生长。肌动蛋白免疫组化及荧光染色显示,细胞传至第6代后纯度在98%以上,证实应用此方法分离原代VSMC可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:应用组织贴块法培养小鼠VSMC,操作简单,结果稳定,纯度较高,具有推广应用价值。     

组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的探讨以原代培养的方法获得活力稳定、高度纯化的大鼠血管平滑肌细胞的体外模型,并为相关研究提供所需的试验材料。方法采用组织贴块法进行细胞原代培养,胰酶消化传代,液氮冻存,并应用倒置相差显微镜和SP法免疫组化染色对细胞进行鉴定。结果85％的组织块接种存活,传代后90％以上的平滑肌细胞重新贴壁生长,冻存后细胞再行1～2次传代后可恢复增生活力。显微镜下细胞呈典型的“谷峰状”生长,SP法免疫组化染色显示胞质内“平滑肌肌动蛋白表达阳性。结论组织块贴壁法简便易行,短期内可获大量符合后续试验要求的血管平滑肌细胞。     

小鼠原代血管平滑肌细胞改良分离方法的建立

目的：建立方便、快速、高效的小鼠原代血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）的分离培养方法,为相关研究提供快速获取原代VSMC的方法技术。方法：分离小鼠主动脉,用I型胶原酶消化血管组织去除内皮细胞等杂细胞;将血管切成1mm。大小组织块种植于六孔细胞培养板孔底,用分离培养液诱导原代VSMC细胞的繁殖生长。光学显微镜观察细胞形态特征;免疫组化方法鉴定VSMC特异性蛋白α-SMA的表达;RT—PCR方法检测VSMC特异性蛋白α-SMA和SM22α的mRNA表达水平。结果：本方法分离原代VSMC,3d后可见长梭状VSMC从组织块边缘长出,7d后可以进行传代。光学显微镜观察显示,分离细胞具有平滑肌细胞（smooth muscle cell,SMC）形态特征;免疫组化分析显示,分离细胞α—SMA蛋白表达阳性;RT—PCR分析显示,分离细胞中α-SMA和SM22α在mRNA水平高表达。结论：本实验成功建立了一种简便、快捷、高效从组织块分离培养VSMC的改良方法,为快速获得原代VSMC提供了一种适用的方法技术。     

血小板源生长因子-α受体结构域切除对肺血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的：探讨从血小板源生长因子－α（PDGF－α）受体水平阻断对肺血管平滑肌增殖的影响。方法：将组织贴块法培养的肺动脉平滑肌细胞（VSMC）分别施加小、中、大剂量的受体结构域切除的PDGF－α受体腺病毒重组体Ad5CMV-PaRtr(ACP),通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察细胞不同时相的增殖曲线；采用流式细胞学技术观察不同干预条件下VSMC细胞周期的变化。结果：中、大浓度ACP对细胞增殖有明显抑制作用。中、大剂量ACP干预后，VSMC生长明显受抑，波峰减弱或消失，第7－9天生长曲线才呈现上升趋势。在中浓度的ACP作用下，加入PDGF－BB不能促进VSMC的增殖。ACP干预前后，VSMC增殖周期中各期细胞构成发生显著的变化，以G0＋G1期细胞增多，S＋G2＋M期细胞减少为特征。与对照组相比，各组的G0＋G1期细胞均有显著升高（P＜0．05）。小剂量与中剂量、中剂量与大剂量间G0＋G1期细胞有显著性差异（P＜0．05）。结论：ACP作为细胞增殖抑制剂，能在中、大剂量下明显抑制VSMC的增殖，可使G0／G1期细胞数明显增多，且与ACP有剂量依赖关系。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)体外分离培养和扩增方法,观察MMSCs在体外培养的生物学特性,为MMSCs的临床应用奠定技术基础.方法 采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增MMSCs,光镜观察MMSCs生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析MMSCs纯度.结果 MMSCs贴壁生长,呈典型MMSCs形态和生长特征,原代及传代5代内的MMSCs均有活跃的增殖能力,其中CD105阳性细胞＞98%.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法可获得高纯度和高增殖活性的MMSCs,成人MMSCs至少在传代培养5代内生长旺盛并维持其生物特性,可满足临床治疗和人体生物组织研究要求.     

人脐带间充质干细胞分离培养建立及其生物学特性观察

目的:建立从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法,并探讨UC-MSCs的生物学特性。方法:分别采用原代贴壁培养法和酶消化法(胶原酶Ⅱ和胰酶)分离培养UC-MSCs,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术检测第3代以后的UC-MSCs表面特异标志物表达,MTT法检测P7细胞增殖情况。UC-MSCs同外周血单个核细胞共培养后,用MTT法测定细胞增殖率,Hoechst与PI双染色,观察UC-MSCs对健康人淋巴细胞增殖的影响。结果:原代贴壁培养法1周左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出,成簇生长;酶消化法3~5天可见成纤维样细胞均匀生长。传代培养后,UC-MSCs均呈长梭形、旋涡状生长;细胞核大,核仁清晰;免疫表型:CD29阳性率为(95.71±2.23)%,CD31和CD34阳性率分别为(2.47±0.54)%和(3.24±0.34)%;第7代UC-MSCs仍具有较强的分裂增殖能力。UC-MSCs对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性,而淋巴细胞对UC-MSCs的生长未见影响。结论:从人脐带中成功分离培养的细胞具有UC-MSCs生物学特性。     

补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷含药血浆抗血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用

目的：研究补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷（total Panax notoginseng saponins,TSPN）含药血浆对血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖的影响。 方法：采用血浆药理学方法及PDGF-BB诱导VSMC增殖模型。以甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测空白血浆对VSMC生长的影响和含药血浆对PDGF-BB诱导的VSMC增殖的半数抑制浓度,确定补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷用药浓度。MTT法和流式细胞术检测补阳还五汤及有效组分和TSPN、阿托伐他汀对VSMC增殖活性及细胞周期的影响。 结果：PDGF-BB剌激后,VSMC增殖活性显著增强,G0/G1期细胞数减少,G2/M期和S期细胞数增多。与PDGF-BB剌激组比较,补阳还五汤、有效组分生物碱和苷、TSPN、阿托伐他汀等含药血浆均可抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖,增加G0/G1期细胞数,减少G2/M期和S期细胞数。 结论：补阳还五汤及其有效组分和TSPN均可抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖。生物碱和苷可能为补阳还五汤中抗VSMC增殖的主要药效物质,补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷具有与阿托伐他汀、TSPN相似的抗VSMC增殖的作用。     

血小板源生长因子α受体结构域切除对肺血管平滑肌细胞增殖和c-sis基因表达的影响

目的 探讨从血小板源生长因子α（PDGF—α）受体水平阻断对肺血管平滑肌细胞增殖的影响。方法 在肺动脉平滑肌细胞（VSMC）培养液中分别给予不同剂量的受体结构域切除的PDGF—α受体腺病毒重组体Ad5CMV—PaRtr（ACP）,对细胞不同时相的增殖曲线和c—sis原癌基因表达进行测定。结果 5ml／L、10ml／L剂量ACP对细胞增殖有明显抑制作用。在5ml／LACP作用下,加入PDGF-BB不能促进VSMC的增殖。不同剂量的ACP可使c—sismRNA的表达上调。5ml／LACP作用下,加入PDGF—BB可下调c—sis mRNA的表达。结论 5ml／L、10ml／LACP能明显抑制肺VSMC的增殖,使c—sismRNA的表达上调。     

tPA和VEGF165基因共表达质粒对人血管细胞增殖的影响和纤溶作用

目的：观察组织纤溶酶原激活物（tPA）和血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因共表达质粒在血管平滑肌细胞（VSMC）中的表达,并研究表达产物对血管内皮细胞（VEC）和VSMC增殖的影响和纤溶作用。方法：用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC,逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达;纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性;取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165质粒的VSMC培养基培养VEC和VSMC,用四甲基偶氮唑盐（MTT法）和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响。结果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后,RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用,而对VSMC增殖无作用。结论：tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165,为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础。     

四妙勇安汤的有效成分对血管内皮细胞增殖的影响

目的：研究四妙勇安汤的有效成分对脐静脉内皮细胞（ECV304）增殖的影响,以探讨其促血管新生的可能机制。方法：体外培养ECV304,单体进行干预,利用MTT及BrdU-ELISA法检测其对ECV304增殖的影响。结果：绿原酸10^1ng/ml-10^2ng/ml,阿魏酸10^2ng/ml-10^4ng/ml浓度组为促细胞增殖的优选浓度。结论：绿原酸、阿魏酸促内皮细胞增殖能力与血清有协同作用。