RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

目的：探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞侵袭与转移的影响。方法：体外合成mTOR siRNA,并转染HepG2细胞24 h,同时设无义对照组（转染无义对照siRNA）、空白对照组（转染空脂质体）及正常对照组（不转染）。采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达;应用Transwell小室细胞体外实验检测转染后肝癌HepG2细胞的穿膜细胞数,评价肝癌细胞体外侵袭和转移能力的变化。结果：mTOR siRNA转染组HepG2细胞mTOR蛋白的表达低于各对照组（P〈0.05）;HepG2细胞侵袭和转移力均显著低于各对照组（P〈0.05）。结论：mTOR siRNA可有效抑制HepG2细胞mTOR蛋白的表达,且能抑制HepG2细胞的侵袭和迁移。     

靶向c-myc基因小RNA干扰对胆囊癌细胞侵袭运动的影响

目的 研究c-myc基因在胆囊癌侵袭和转移中的作用及其机制。方法 采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测亲代和高转移胆囊癌细胞系中c-myc基因表达,设计靶向c-myc的干扰性小RNA(siRNA)转染高转移的胆囊癌细胞,体外Transwell实验研究c-myc siRNA对胆囊癌高转移细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质印迹法检测转染c-myc siRNA后c-myc下游部分信号通路的变化。结果 高转移细胞中c-myc基因表达高于亲代细胞,转染c-myc siRNA后,c-myc的表达在转录和翻译水平均降低。同时GBC-SD/M3细胞的转移和侵袭能力受到抑制。对c-myc下游信号通路的检测发现LIN28的表达下调。结论 c-myc在高转移的胆囊癌细胞中表达上调;通过siRNA下调其表达后可以抑制胆囊癌细胞的转移和侵袭,这种抑制作用可能与LIN28的下调有关。     

HIF-1α516对人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响

目的观察HIF-1α516对人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响。方法人肝癌HepG2细胞分为空白组(同步培养,不做任何处理)、对照组(转染siRNA)和siRNA干扰组(转染HIF-1α516 siRNA)。siRNA和HIF-1α516 siRNA通过脂质体转染HepG2,转染18h后Western blot检测HepG2细胞中HIF-1β核蛋白和全细胞蛋白的表达、ELISA法检测细胞培养上清中MMP-2、MMP-9的含量,Transwell小室观察HepG2的转移侵袭能力。结果 HIF-1α516 siRNA能显著降低HepG2细胞HIF-1α516mRNA的表达(降低70.0%)(P<0.01);增强HepG2细胞的侵袭转移能力(增强71.10%)(P<0.01)。HIF-1α516siRNA对全细胞HIF-1β蛋白的表达无影响,但能促进HIF-1β蛋白的核转移(增强64.1%)(P<0.01)。HIF-1α516 siRNA能明显升高HepG2细胞培养上清中MMP-2、MMP-9蛋白表达,分别升高37.72%、55.46%(P<0.01)。结论 HIF-1α516能抑制HepG2的转移侵袭,其机制可能与抑制HIF-1β的核转移有关。     

PLCε特异性shRNA对人膀胱癌生物学行为的影响

目的探讨人源磷脂酶Cε(PLCε)特异性短发夹RNA(shRNA)对人膀胱癌增殖、凋亡、侵袭、转移能力的影响。方法用携带PLCεshRNA基因的真核表达质粒pGenesil-PLCε转染BIU-87细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测各组细胞PLCεmRNA和蛋白的变化。分别用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、流式细胞术和免疫组化检测BIU-87细胞及裸鼠移植瘤增殖情况和细胞周期的变化;采用RT-PCR检测各组细胞Bcl-2、Bax mRNA的变化;采用Transwell小室体外侵袭法及明胶酶谱分析细胞的侵袭能力。结果转染pGenesil-PLCε质粒的细胞可明显抑制PLCε基因和蛋白表达水平(P<0.05);MTT、流式细胞术与免疫组化检测结果表明转染pGenesil-PLCε质粒的细胞生长明显受抑制(P<0.05),且细胞周期阻滞于G0/G1期;转染pGenesil-PLCε质粒的细胞Bcl-2/Bax mRNA明显降低(P<0.05);明胶酶谱及侵袭实验显示转染pGenesil-PLCε质粒的细胞侵袭、转移能力明显下降(P<0.05)。结论特异性shRNA干扰PLCε基因可抑制...     

MTA1靶向RNA干扰对人肝癌HepG2细胞生物学行为影响的研究

目的 观察转移相关基因1(MTA1)特异性siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 体外构建2个MTA1特异性siRNA表达载体(pRNAi-1、pRNAi-2),实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及MTA1 siRNA重组质粒转染组,转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量RT-PCR检测MTA1 mRNA表达情况,检验其对细胞的RNA干扰效果;采用MTT法分析其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.结果 测序表明MTA1干扰序列完全正确;pRNAi-1与pRNAi-2表达质粒有效抑制肝癌细胞株HepG2细胞中MTA1的表达,MTT 法检测结果显示转染重组质粒组细胞体外生长的抑制率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01);流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01).结论 成功构建了MTA1干扰真核表达载体,重组MTA1特异性siRNA质粒可抑制肝癌细胞中MTA1的表达,并抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡.     

小干扰RNA抑制胃癌细胞肝素酶表达及侵袭的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）技术封闭胃癌细胞系SGC7901肝素酶表达,观察其对肿瘤细胞侵袭能力的影响。方法 体外转录合成小干扰RNA（siRNA）,经脂质体转染胃癌细胞系;结合逆转录（RT）-PCR,Western印迹检测类肝素酶mRNA及蛋白质表达;通过体外侵袭实验评价肝素酶RNAi后胃癌细胞系的侵袭能力变化。结果 肝素酶siRNA分子可以特异性地抑制SGC7901细胞肝素酶mRNA,抑制率达（70±6）％;肝素酶RNAi后SGC7901细胞的侵袭抑制率达（61±36）％。结论 靶向肝素酶基因的siRNA分子能特异性抑制其蛋白表达水平,降低肿瘤细胞的侵袭能力。肝素酶是促进胃癌细胞侵袭转移的关键分子,并可为抑制胃癌侵袭转移提供新策略。     

小干扰RNA沉默EGFR基因对卵巢癌细胞侵袭力的影响

目的 通过小干扰RNA(siRNA)沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达,旨在探讨其对卵巢癌SKOV3细胞体外侵袭力影响.方法 体外构建靶向EGFR基因siRNA质粒和阴性对照质粒, Lipofectamin 2000介导转染到SKOV3细胞中.实验分空白对照组、非特异性转染组、特异性转染组.采用RT-PCR和免疫细胞化学法检测EGFR基因mRNA和蛋白表达水平;采用平板克隆形成法检测细胞生长增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭力.结果 特异性转染组细胞EGFR mRNA 的表达与其他两组相比明显减弱(F=50.45,q=12.87、11.72,P<0.01),EGFR 蛋白表达明显下调(F=61.54,q=14.58、11.46,P<0.01);细胞生长增殖能力减弱(F=130.12,q=21.12、18.15,P<0.01);体外侵袭力明显降低(F=34.09,q=11.26、8.34,P<0.01).结论 siRNA可以有效抑制SKOV3细胞EGFR基因的表达,从而抑制SKOV3细胞增殖和侵袭能力.     

特异性siRNA沉默LASP-1对HepG2细胞增殖和迁移的影响

目的应用RNA干扰技术沉默细胞内LASP-1蛋白的表达,探讨LASP-1蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的作用。方法根据LASP-1mRNA编码序列设计RNA干扰靶点并构建特异性小干扰RNA（siRNA）,通过脂质体转染入HepG2细胞,采用Westernblot法检测LASP-1蛋白的表达。采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell和划痕愈合实验方法,观察HepG2细胞增殖及迁移情况。结果（1）LASP-1siRNA对LASP．1蛋白表达水平有显著的下调作用（P〈0．05）。（2）体外实验结果显示,与HepG2组及阴性对照组相比,siRNA组HepG2细胞增殖和克隆形成率明显被抑制（P〈0．05）,其迁移能力也下降（P〈0．05）。结论下调LASP-1蛋白表达可显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力,提示LASP-1在肝癌细胞恶性增殖和转移过程中具有重要作用,为临床上寻找抑制肝癌增殖转移的靶点提供新的思路和方法。     

RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法 使用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将靶向沉默YAP基因的siRNA序列转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,采用qRT-PCR和Western印迹法分别检测转染后MDA-MB-231细胞中YAP基因及蛋白的表达水平,噻唑蓝(MTT)实验和细胞平板克隆实验检测转染前后细胞增殖的变化,Transwell小室和划痕实验观察转染对细胞侵袭及迁移的影响,流式细胞术评价转染后细胞周期及凋亡的变化情况。结果 转染siRNA后,YAP RNA和蛋白的表达量相对于空白对照及阴性对照组均明显下降(P<0.01)。MTT实验及细胞平板克隆实验显示,siRNA干扰YAP表达可以显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性;Transwell小室及划痕试验显示,siRNA干扰YAP的表达可以明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力;细胞周期实验显示,沉默YAP后,细胞周期出现G₀/G₁期阻滞,细胞凋亡检测证实沉默YAP后细胞凋亡率并未出现明显上升。结论 抑制YAP在乳腺癌细胞的表达可有效降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,改变细胞周期分布,但对细胞凋亡无明显影响。     

乙肝病毒X基因阻断降低肝癌细胞HepG2.215与纤维连接蛋白的黏附

目的探讨乙肝病毒X基因（HBX）在肝细胞癌（HCC）侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hH1neo质粒,构建针对HBX的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3,转染肝癌细胞株HepG2.215,用荧光定量PCR仪检测siRNA对HBX mRNA表达的抑制作用,用Western blot法检测siRNA对HBX蛋白表达的抑制作用。以Transwell小室测定HepG2.215细胞与纤维连接蛋白（Fn）的体外黏附能力。结果成功构建shRNA表达载体,shRNA表达载体均可不同程度地抑制HBX的表达,其中psiRNA1对HBX的抑制作用最强,对HBX mRNA抑制率达80.27%,对HBX蛋白的抑制率为65.59%;细胞体外黏附能力受到明显抑制,在培养至48、72h后,对照组和转染组跨膜细胞数分别为442.6±57.1vs376.4±55.2和588.2±70.1vs513.6±68.5,两时相点均有明显差异（P〈0.05）。结论阻断HBX的表达可明显抑制肝癌细胞HepG2.215的体外侵袭性生长。     

CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251体外增殖和侵袭能力的影响,为CXCR4 shRNA治疗胶质瘤提供实验依据. 方法 用脂质体LipofectimineTM2000将CXCR4-shRNA转染U251细胞,MTT实验检测转染细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力. 结果 与转染非特异的pGPU6/GFP/NC组和未转染组比较,转染CXCR4-shRNA载体pGPU6/GFP/Rac 1-421组的U251细胞CXCR4 mRNA显著降低(P＜0.05),并且细胞体外增殖能力减弱(P＜0.05),侵袭到滤膜底面的细胞数为36.67±9.76,分别低于对应的pGPU6/GFP/NC组和未转染组(P＜0.05). 结论 CXCR4 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-421可下调U251细胞CXCR4的表达,抑制U251细胞的增殖和迁移侵袭能力,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用.     

组织因子对人类大肠癌培养细胞侵袭能力的影响

目的：分析组织因子表达对人类大肠癌细胞(HT—29细胞)体外侵袭能力的影响。方法：利用构建有正义／反义组织因子cDNA(TF cDNA)的真核表达载体pcDNA3．1／Zeo，以脂质体法转染HT—29细胞，经验证转染成功的HT—29细胞采用Western印迹分析检测组织因子的蛋白表达水平并进行基质胶(Matrigel)侵袭实验观察细胞体外侵袭能力的变化。结果：转染了正义TFcDNA的HT—29细胞的组织因子表达水平及侵袭能力较未转染的HT—29细胞升高；转染了反义TFcDNA的HT—29细胞的组织因子表达水平及侵袭能力较未转染的HT—29细胞相比降低。结论：组织因子可以增加人类大肠癌细胞的体外侵袭能力。     

Ｌｉｖｉｎ特异性ｓｉＲＮＡ表达载体在胃癌细胞中的稳定表达

目的:构建以Livin基因为靶基因的siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo/Livin,获得稳定沉默Livin基因的胃癌细胞SGC-7901/siRNA-Livin.方法:化学合成siRNA,Livin寡核苷酸,将其分别克隆进载体pGPU6/GFP/Neo,进行核酸序列测定.脂质体法转染SGC-7901细胞,半定量RT-PCR和Western blot检测Livin基因在SGC-7901细胞中的沉默效率,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆.结果:酶切分析显示,所有质粒均为阳性重组载体,核酸测序表明合成的序列准确插入pGPU6/GFP/Neo载体,G418筛选基因转染SGC-7901细胞后形成稳定克隆.其中pGPU6/GFP/Neo/Livin-4转染后Livin mRNA沉默效率大于70%.结论:成功获得Livin特异性siRNA表达载体,SGC-7901细胞Livin基因的表达受到抑制,转染胃癌细胞后获得SGC-7901/siRNA-Livin细胞克隆.     

PD-L1对肝细胞癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的 探讨程序性死亡配体(PD-L1)在肝癌细胞增殖、侵袭、迁移中的作用。 方法 转染有效的PD-L1基因siRNA干扰片段进入人肝细胞癌HepG2细胞中,下调细胞中PD-L1表达。采用荧光定量PCR法检测HepG2细胞中PD-L1基因表达情况,采用Western blotting法检测HepG2细胞中PD-L1蛋白表达情况。通过MTT实验观察其对HepG2细胞增殖能力的影响,采用细胞划痕实验检测细胞融合率,采用Transwell小室进行侵袭实验,观察其对HepG2细胞迁移及侵袭能力影响。 结果 下调PD-L1后,HepG2细胞PD-L1基因表达量、PD-L1蛋白表达量和细胞增殖能力、迁移能力及侵袭能力均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01),阴性对照组和正常对照组上述指标差异均无统计学意义(P＞0.05)。 结论 下调PD-L1后,肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力有一定程度下降,PD-L1可能成为肝细胞肝癌免疫治疗中的一个新基因靶位。      

microRNA-10b及靶基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及侵袭能力的影响

目的  探讨microRNA-10b（miR-10b）及其靶基因同源异性盒基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及转染miR-10b对肝癌细胞侵袭性能力的影响。方法  分析HOXD10基因在3种肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中的基础表达量,筛选出HOXD10基础表达量高的HepG2作为后续研究对象。设计合成外源性miR-10b序列,用脂质体瞬时转染肝癌细胞株,设置miR-10b转染组、无关序列转染组（阴性对照组）和未处理组（对照组）。用RT-PCR及Western blot检测肝癌细胞转染miR-10b后HOXD10基因及蛋白表达量的变化,细胞侵袭实验研究转染miR-10b对肝癌细胞侵袭能力。结果  在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是（1.24±0.23）、（1.00±0.02）,P >0.05差异无统计学意义。在蛋白分析HepG2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1 968.742,蛋白水平表达降低。HOXD10基因在肝癌细胞株HepG2的表达量显著高于Huh7和SMMC-7721;miR-10b成功转染HepG2后,HOXD10基因表达水平与对照组比较无明显变化,但HOXD10蛋白表达量与对照组比较下降及侵袭性也增强。结论  miR-10b可能通过抑制靶基因HOXD10表达发挥作用,促进肝癌细胞的侵袭。

     

沉默GRP94基因对肝癌细胞的影响

目的:探讨GRP94基因对肝癌细胞的影响。方法:用脂质体法转染GRP94 siRNA序列及阴性对照序列,采用实时荧光定量PCR及Western blotting方法检测转染后GRP94的mRNA和蛋白表达水平。以CCK-8和流式细胞仪来检测细胞增殖和细胞凋亡的情况。以划痕实验和Transwell方法检测转染后细胞的迁移和侵袭能力。结果:在肝癌细胞HepG2中瞬时转染siRNA-GRP94序列及阴性对照序列后,其mRNA和蛋白表达显著减低;转染48 h后,细胞增殖能力明显下降,而细胞凋亡率明显上升。划痕实验检测发现24 h细胞愈合率明显抑制,Transwell实验发现迁移和侵袭至下室的细胞数目显著减少。结论:GRP94基因对肝癌细胞HepG2凋亡有抑制作用,促进增殖、迁移和侵袭能力,为进一步研究GRP94在肝细胞肝癌发生和进展中的作用奠定了基础。     

miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响

目的：研究 miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭、迁移能力的影响及其可能机制。方法将 miR-98mimics、mimics-NC、miR-98inhibitor、inhibitor-NC 瞬时转入肝癌 HepG2细胞内,应用噻唑盐( MTT)法、流式细胞仪、Tr-answell 小室实验检测 miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响,进一步用 Western blot 法检测各组 Bcl-2蛋白的表达水平。结果 MTT 实验表明 miR-98过表达后,肝癌细胞的增殖能力明显低于对照组;Annexin V-FITC / PI 凋亡实验证实上调 miR-98表达后,细胞的凋亡率较对照组升高;Transwell 小室实验表明上调 miR-98可使肝癌细胞的侵袭、迁移能力减弱。而当 miR-98被抑制后,肝癌HepG2细胞的增殖及侵袭、迁移能力则明显增强,凋亡率则下降。 Western blot 实验检测发现 miR-98过表达后,Bcl-2的表达降低。结论 miR-98可能在肝癌的发生、发展中发挥着抑癌基因的作用;miR-98可能通过下调 Bcl-2的表达,促进肝癌 HepG2细胞凋亡。     

肝星状细胞经趋化因子SDF-1/CXCR4轴途径促进肝癌细胞侵袭的作用及其机制

目的：探讨肝星状细胞（HSC）通过SDF-1/CXCR4轴对肝癌细胞侵袭的影响和可能机制,为研究肝癌的侵袭过程提供依据。方法: 采用Western blotting和RT-PCR检测HSC LX02和肝癌细胞MHCC97、SMMC7721、Hep3B、HepG2中SDF-1和CXCR4的表达。采用Transwell实验检测LX02共培养或外源性SDF-1干预对肝癌细胞HepG2以及CXCR4基因沉默后的HepG2侵袭的影响。Western blotting法检测上皮标志E-Cadherin和间质标志Vimentin的表达水平。结果：与肝癌细胞比较,LX02中趋化因子SDF-1呈高表达（P<0.05）。4株人肝细胞癌细胞均有CXCR4高表达。HSC或SDF-1均能促进肝癌细胞HepG2侵袭（P<0.05）,并诱导E-Cadeherin蛋白表达下调,Vimentin蛋白表达上调。通过RNA干扰技术靶向沉默肝癌细胞CXCR4基因后,HSC和SDF-1对肝癌细胞HepG2侵袭能力均无明显影响（P>0.05）,肝癌细胞E-Cadeherin、Vimentin蛋白及mRNA表达水平亦无明显变化。结论：HSC可通过SDF-1/CXCR4轴促进肝癌细胞侵袭,其机制可能与诱导肝癌细胞上皮-间质转化有关。     

Amotl2促进肝细胞肝癌血管生成拟态及EMT形成

目的:研究Amotl2对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响及其在诱导肝癌上皮间充质转化（EMT）及血管生成中的作用。方法:将Amotl2过表达质粒和干扰质粒分别转染至肝癌细胞系HepG2和Bel7402中,Western blot检测转染前、后HepG2和Bel7402中Amotl2、EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin）表达变化情况;划痕、侵袭实验检测Amotl2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响;三维培养检测Amotl2对HCC细胞形成血管样结构的影响。结果:促进Amotl2表达后HepG2表现出EMT样改变,E-cadherin表达下降、Vimentin表达上升、细胞迁移侵袭和三维成管的能力增强。抑制Amotl2表达后Bel7402由间质样表型转变为上皮样表型,E-cadherin表达上升、Vimentin表达下降、细胞迁移侵袭和三维成管的能力减弱。结论:Amotl2可能通过诱导EMT促进原发性肝癌的迁移侵袭能力和血管生成拟态的形成。