丁型肝炎病毒核酶在分子水平对丙型肝炎病毒RNA的反式剪切活性

锤头状核酶(hammerhead ribozyme)和发夹状核酶(hairpin ribozyme)能特异性定点剪切靶RNA分子,可用于抗病毒、抗肿瘤等基因治疗［1］。但假结样核酶（pseudoknot ribozyme）,如丁型肝炎病毒（HDV）核酶,包括基因组核酶（genomic ribozyme）和抗基因组核酶（antigenomic ribozyme）,是否具有抗病毒等活性,迄今研究鲜见［2］。本研究旨在评价基因组核酶对丙型肝炎病毒（HCV）RNA在分子水平的剪切活性。     

HepG2.9706细胞内HDV核酶对HCV RNA抑制活性的初步研究

目的探讨HDV核酶在细胞内抑制HCV RNA的可能性.方法将重组载体转染至转基因细胞HepG2.9706中,通过荧光定量PCR检测细胞和培养上清中的HCV RNA,初步探讨HDV核酶对HCV RNA的抑制活性.结果①RzCl,RzC2,RzC3 3组HDV核酶定向插入到真核表达载体.②在转基因细胞HepG2.9706中,pCl-RzCl、pC1-RzC2、pCl-RzC3对HCV-5′NCR-C RNA抑制活性分别为69.2%,38.7%、4.2%.结论①成功构建了3个HDV核酶重组表达载体.②pC1-RzC1、RC1-RzC2在转基因细胞HepG2.9706具有抑制HCV-5′NCR-C RNA的活性.     

丙型肝炎病毒核心基因靶向性M1GS核酶的构建及鉴定

目的 构建一种具有丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)靶向性的M1GS核酶,为进一步研究引导序列(guide sequence,GS)引导核酶P在RNA水平阻断HCV核心基因(core gene,C)的表达作前期基础.方法 选择HCV基因组中序列相对保守且在病毒复制过程中起关键作用的核心基因作为靶...     

丁型肝炎病毒研究进展

丁型肝炎病毒（HDV）是第一个被认识的具有环状RNA基因组的动物病毒，其病毒抗原（HDAg)是在RNA介导的RNA复制过程中由HDV抗基因链的ORF（－5）编码的一种核糖核酸蛋白，HDAg和病毒RNA组成病毒核壳体，由于HDV是一缺陷性的负链RNA病毒，参加类病毒和负链RNA病毒，使得HDV的研究有了很快发展，现将近年来有关HDV的研究进展综述如下。     

丙型肝炎病毒母婴垂直传播的研究

目的：了解丙型肝炎病毒（HCV）母婴垂直传播情况,方法：采肜酶联免疫法（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）检测1047例肝病孕产妇血清丙型肝炎病毒抗体（抗－HCV）和丙型肝炎病毒基因（HCV－RNA）,对HCV感染产妇血清进行HCV分型及半定量分析。再对HCV感染产妇的丈夫静脉血及新生儿脐血,出生后24小时的,1,6,12个月股静脉血进行抗－HCV,HCV－RNA和HCV分型的检测,结果：1047例肝病孕产妇中有12例（1．15％）HCV感染,其丈夫血清抗－HCV,HCV－RNA均为阴性,而12名新生儿中有3例脐血及出生后24小时内外周血均抗－HCV阳性其中2例HCV－RNA同时阳性,仅1例婴儿在出生后1,6,12个月时检测抗－HCV与HCV－RNA均阳性,且与其母所感染的HCV基因型相同,其余2例婴儿出生后1个月均阴转,本组HCV母婴传播率为8．3％,结论：支持我国存在HCV母婴垂直传播。     

核酶及突变核酶在体外对HBV mRNA的切割作用

目的：探讨多位点核酶对乙型肝炎病毒（HBV）信使核糖核酸（mRNA)的切割作用，以及保守碱基突变后对切割活性的影响。方法：利用计算机辅助设计针对HBV C区基因的多位点核酶及保守碱基突变的双位点核酶，构建多位点核酶及双位点突变核酶的自剪切载体（pGEMRz123,pGEMmRz12)，观察核酶及突变核酶对RNA的切割作用。结果：构建后的多位点串联核酶及突变核酶的自剪切转录载体在体外转录后，其顺式核酶可发生自剪切，并可将目的的核酶释放出来。多位点核酶对HBV mRNA有明确的切割作用，而保守碱基突变后对HBV mRNA则无切割作用。结果 ：抗HBV多位点酶在体外可明确切割HBV靶RNA，突变后的核酶无切割活性，保守碱基为核酶保持活性所必需。     

PCR法与ELISA法检测丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒比较5

目的：探讨PCR与ELISA2种方法检测丙型肝炎病毒和惭型肝炎病毒的差异和临床意义。方法：随机抽取无偿献血者标本300份，分为ALT升高组和ALT正常组，用ELISA法检测抗－HCV和HbsAg，用RT－PCR检测HCV－RNA和HBV－DNA。结果：抗－HCV阳性标本26例阳性率为8．7％，经RT－PCR检测，HCV－RNA均为阳性，抗HCV阴性的标本中有2例HCV－RNA为阳性。HCV－RNA的阳性率为16％，2种方法检测结果差异有统计学意义（P＜0．01）；300份标本中HBsAg阳性和HBV－DNA阳性比率分别为11．3％和12．7％，两者无明显差异（P＞0．05）。结论：ELISA方法检测丙型肝炎病毒存在一定的漏检现象，应用RT－PCR检测HCV－DNA利于早期诊断，也是筛选献血员是否携带丙型肝炎病毒的较可靠方法。     

中国人丙型肝炎病毒基因组λgtll cDNA库的免疫筛选与鉴定

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是散发性及输血后肝炎的主要病原体,易致慢性肝炎、肝硬变或肝细胞癌。为了研究中国HCV基因组的变异及结构特征,我们从中国丙型肝炎(丙肝,Hepatitis C,HC)患者血浆中提取HCV基因RNA,用随机引物合成HCV cDNA并构建其λgtll cDNA库。对此基因库进行了免疫筛选,并对2个阳性克隆(Q349和Q653)在pUC18质粒中进行了亚克隆。序列分析结果表明:Q349和Q653分别来自HCV基因组核心(C)区(第554～902位)和非结构3(NS3)区(第4175～4827位)。Q349和Q653与HCV原型相应序列在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为86.8％,80.2％和97.3％,93.1％;与日本HCV相应序列间有更高的同源性,故属于HCVⅡ组。特异性灾验表明,Q349和Q653的编码多肽可与HC人群血清特异反应而不与正常人血清反应,且Q653与中国HC血清反应的阳性率(95.8％)比日本HC血清的阳性率(85.7％)高。表明根据中国HCV基因序列(特别是非结构区序列)设计引物或合成多肽将更适合中国人群HCV感染的检出。     

丙型肝炎病毒结构区基因变异的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）结构区主变异在HCV感染慢性化中的作用。方法：采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增HCV的C、E1及E2／NS1区核苷酸片断（1kb）,扩增产物进行克隆,以单链构象多态性（SSCP）／异质性双体分析（HDA）方法对每份血清中30个克隆的C／E1和E2／NS1区准种（Quasispecies）进行优化筛选,分析HCV急性感染者和持续性感染者血清种复杂性。结果：HCV的C／E1区和E2／NS1区增片段形成的SSCP条带间差异明显,但E2区形成的异质性双体与同源双体之间差距准种复杂性的增加与病毒持续性感染有关。     

丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是单股正链RNA病毒，属黄病毒科丙型肝炎病毒属。全长约9．4kb，其序列为：341b的5’非编码区(5’URT)，编码3011个氨基酸的长开放读框，约27b的3’非编码区(3’URT)。在病毒复制中，氨基端有三个蛋白(C、E1、E2／NSl)，羧基端有四个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)。由于RNA复制酶的低保真性及缺乏校正功能，HCV呈高度异质性；不同地区，不同患者，甚至同一患者在不同病程中HCV分离株，无论是核苷酸序列，还是氨基酸序列均有显著差异^[1][2][3]。本文就丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义作一综述。     

抗乙型肝炎病毒特异联合型核酶的体外切割作用

目的：探讨单一及多位点核酶对乙型肝炎病毒靶ＲＮＡ的切割作用。方法：利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶及特异联合型核酶,构建三个核酶各自及三个核酶串联的自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１２３）观察单一及串联核酶（Ｒｚ１２３）对靶ＲＮＡ的切割作用。结果：构建的串联核酶自剪切转录载体体外转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶ＲＮＡ,串联     

反义寡脱氧核苷酸抑制丁型肝炎病毒基因链核酶活性的作用

目的探讨反义寡脱氧核苷酸（ａｓＯＤＮ）抑制丁型肝炎病毒（ＨＤV）核酶活性以阻断ＨＤＶ复制的作用，方法在构建含ＨＤＶ基因链和抗基因链核酶ｃＤＮＡ片段的重组质粒ｐＨＤＶｒｚ２７７的基础上，体外转录出１１２聚核苷酸（ｎｔ）的基因链核酶，观察５条ａｓＯＤＮ抑制核酶活性的作用，并对作用最好的一条进行序列优化。结果 互补于６８３－７０３ｎｔ的自裂位点和茎样结构（ｓｔｅｍ）１区的ａｓＯＤＮ可完全抑制该１１２ｎｔ核酶的活性，互补于７５６－７７０ｎｔ（ＳＳｒＢ区）和７２１－７３５ｎｔ（ＳＳｒＡ区）的ａｓＯＤＮ亦有较高活性，抑制率分别为６９．３６％和４８．６４％，而对应于７３６－７５０ｎｔ（ｓｔｅｍｗ区）和７０４－７２０ｎｔ＜ＳＳｒＣ区）者几乎无抑制作用。对互补于６８３－７０３ｎｔ的ａｓＯＤＮ进行序列优化发现，封闭自裂位点在内的１３ｎｔ（６８３－６９５ｎｔ）的ａｓＯＤＮ仍保留很高抑制作用，抑制率大于９０％。结论ｓｔｅｘｎｌ和ＳＳｒＢ在基因链核酶中起重要作用，ａｓＯＤＮ可有效抑制ＨＤＶ基因链核酶活性。     

乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响

惭型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。方法 利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶构建Ｒｚ１核酶自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１）,观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。结果 核酶自剪切转录载体体２上转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶基因在肝细胞中的表达

目的 :构建HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶 (SEAP)基因表达的细胞模型。方法 :用PCR技术扩增HCV 5′NCR片段 ,定向克隆至表达质粒 pSEAP2 Control的SEAP基因上游 ,构建HCV 5′NCR调控SEAP表达的重组质粒 pdNCRSEAP。用脂质体基因转染技术 ,将pdNCRSEAP转染至肝细胞株QSG770 1。用化学发光法检测SEAP的表达 ,并观察不同浓度反义寡聚核苷酸 (ASODN)对SEAP表达的影响。结果 :重组质粒 pdNCRSEAP表达的发光强度为pSEAP2 Control的 76 %,5 μmol和 10 μmolASODN对pdNCRSEAP发光强度的抑制率分别为2 9.2 %和 44 .6 %,而对 pSEAP2 Control的SEAP表达无显著抑制作用 (P >0 .0 5 )结论 :重组质粒 pdNCRSEAP的SEAP表达受HCV 5′NCR调控 ,为以HCV 5′NCR为靶位点的药物评价建立了检测方便的细胞模型。     

丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的 建立接近体内自然感染状态并能长期复制的丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型．方法 用HCV阳性血清感染人肝癌细胞株HepG2、SMMC 7721及胎肝细胞株L02，继续培养60d，用巢式逆转录-聚合酶链反应(nested RT-PCR)检测培养细胞及上清中正、负链HCV RNA。结果 HepG2、SMMC 772l在感染后第2-30d，L02在感染后第3-30d细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后第3-30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第3l—60d仍可间断检出，但复制程度逐渐减弱。3株细胞的培养上清中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基本一致。培养上清中均末检出HCV负链RNA。结论 HePG2、SMMC772l及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期复制。而HePG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的构建

目的将重组丁型肝炎病毒基因组作为乙型肝炎病毒特异性核酶的载体,探讨解决核酶在实际应用中的保护性运载、靶向性和特异性问题。方法设计了乙型肝炎病毒特异性锤头型核酶结构,采用重组引物,结合“不对称ＰＣＲ”和“ＭｅｇａＰｒｉｍｅｒＰＣＲ”方法将所设计的锤头型核酶基因替代插入到了型肝炎病毒基因组５'端高变区,重组体经ＰＣＲ初步鉴定后,克隆到Ｔ载体（ｐＴＡｄｖ）Ｔ７启动子下游,经限制性内切酶酶切、序列测定分析。结果与结论证实该重组作为预期的乙型肝炎病毒特异性核酶－丁型肝炎病毒基因组重组体,为进一步的体外切割和细胞内与乙型肝炎病毒相互作用的研究提供了基础。     

Selection and application of serotypical synthetic peptides derived from hepatitis C virus NS5A region

Background   Numerous studies have reported a relationship between hepatitis C virus (HCV) genotype and the response to interferon therapy. Despite high sensitivity and specificity, genotyping methods can be performed only on HCV RNA positive samples. Serotyping might be a rapid and cost effective method for determining HCV genotypes, especially in patients with previously undetectable HCV RNA. In this study, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method for HCV serotyping with the genotype specific, synthetic peptides derived from HCV nonstructural 5a (NS5A) region was developed.
Methods  Based on 45 sequences, representing HCV genotypes 1-6 from Genebank, we synthesised 305 overlapping 30-mer peptides within NS5A region at positions 2182-2343 of HCV. All peptides for antigenic reactivity were tested by enzyme immunoassay with 69 human sera with antiHCV positive representing genotype 1-6. Forty hepatitis C patient sera were serotyped using serotype specific, synthetic peptides and genotyped by sequencing analysis.
Results  The correspondence of amino acids in HCV NS5A region with amino acids in positions 2182-2343 was very low among different genotype peptides. The highly conserved sequences were residues 2182-2211(R1), 2272-2301 (R7) and 2302-2331 (R9): the highly variable 2212-2241 (R3) and 2257-2286 (R6). Using 305 peptides, antigenic regions were located in R3, R7 and R9. Eighteen peptides from highly conserved region representing genotypes 1 to 6 showed broad immunoreactivity with sera containing antibody to all HCV genotypes. Immunoreactivity of the peptides from highly variable region was stronger with similar genotype sera.  Twelve unique peptides showed highly, genotype specific, reactivity with types 1 and 3 sera. Type 2 genotype specific peptides had cross reaction with type 3 serum. No type 4, 5 or 6 specific peptides were selected. The serotyping results showed high agreement with sequencing analysis.   
Conclusions  The major antigenic regions in HCV NS5A region were at 2212-2241(R3), 2272-2301(R7) and 2302-2331(R9).  Eighteen peptides from highly conserved region show genotype independent, immunoreactivity, useful for antiHCV antibody test. Twelve peptides from highly variable region show genotype 1 and 3 dependent immunoreactivity, useful for determining HCV serotype, especially for patients with previously undetectable HCV RNA.

     

血透患者血清庚型肝炎病毒RNA及抗体检测

目的:了解血透患者庚型肝炎病毒(HGV)感染率及与其他肝炎病毒重叠感染的情况。方法:收集57份血透患者血清标本,根据HGV RNA保守片段5′非编码区序列,设计了两对引物,采用逆转录巢式PCR扩增HGV RNA,以及EIA法检测HGV IgG抗体。同时还检测了HBV DNA及HCV IgG抗体。结果:57份标本中,4份HGV RNA阳性(7.0％),2份HGV IgG抗体阳性(3.5％)。HGV RNA与HGV IgG抗体呈“分离”现象。4份HGV RNA阳性标本中2份为HBV DNA阳性,2份为HCV IgG抗体阳性;其中1份标本HBV DNA和HCV IgG抗体均为阳性。结论:血透患者HGV感染率高于健康献血员和正常人群,HGV可与HBV和HCV重叠感染。