丁型肝炎病毒核酶在分子水平对丙型肝炎病毒RNA的反式煎切活性

锤头状核酶 (ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ)和发夹状核酶 (ｈａｉｒｐｉｎｒｉｂｏｚｙｍｅ)能特异性定点剪切靶ＲＮＡ分子 ,可用于抗病毒、抗肿瘤等基因治疗[1] 。但假结样核酶 (ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔｒｉｂｏｚｙｍｅ) ,如丁型肝炎病毒 (ＨＤＶ )核酶 ,包括基因组核酶 (ｇｅｎｏｍｉｃｒｉｂｏｚｙｍｅ)和抗基因组核酶 (ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃｒｉｂｏｚｙｍｅ) ,是否具有抗病毒等活性 ,迄今研究鲜见[2 ] 。本研究旨在评价基因组核酶对丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)ＲＮＡ在分子水平的剪切活性。一、材料与方法1.核酶ｃＤＮＡ及引物由…     

剪切HCV RNA的HDV核酶的设计及活性测定

目的：探讨丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus,HDV）核酶用于抗丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）基因治疗的可能性。方法：以HDV基因组核酶的假结样结构为基础,优化其茎IV区,改建基底物结合区,获得3种针对HCV RNA的HDV核酶RzC1、RzC2和RzC3。体外转录获取含HCV RNA5‘－非编码区（5‘-noncoding region,5‘-NCR）及部分C区在内的底物RNA（HCV RNA 5‘－NCR－C）,并进行5‘端放射性标记。在pH7.5、37℃、Mg^2 20mmol/L和去离子甲酰胺2.5mol/L等条件下,将核酶和底物按摩尔比100：1混合,在不同的时间点观察剪切百分率。结论：RzC1、RzC2对底物的剪切百分率随时间延长而递增,90min分别达24.9％、20.3％;未观察到RzC3有剪切活性。结论：经过结构构优化的HDV基因组核酶在合适的位点能够剪切异源性RNA分子HCV RNA。     

抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究

目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素。方法 利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶（ribozyme）,并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒,进行体外切割实验。结果 发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA。 结论 抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考,ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。     

核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略

核酶 (ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子 ,可通过碱基配对特异地与相应的RNA底物结合 ,并在特定的位点切割底物RNA分子。自美国科学家Cech和Altman等发现核酶至今的 2 0多年来 ,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点 ,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达 ,已相     

核酶及突变核酶在体外对HBV mRNA的切割作用

目的：探讨多位点核酶对乙型肝炎病毒（HBV）信使核糖核酸（mRNA)的切割作用，以及保守碱基突变后对切割活性的影响。方法：利用计算机辅助设计针对HBV C区基因的多位点核酶及保守碱基突变的双位点核酶，构建多位点核酶及双位点突变核酶的自剪切载体（pGEMRz123,pGEMmRz12)，观察核酶及突变核酶对RNA的切割作用。结果：构建后的多位点串联核酶及突变核酶的自剪切转录载体在体外转录后，其顺式核酶可发生自剪切，并可将目的的核酶释放出来。多位点核酶对HBV mRNA有明确的切割作用，而保守碱基突变后对HBV mRNA则无切割作用。结果 ：抗HBV多位点酶在体外可明确切割HBV靶RNA，突变后的核酶无切割活性，保守碱基为核酶保持活性所必需。     

特异性切割大鼠c—myc癌基因mRNA核酶的设计

核酸(ribozyme)为具有催化活性的RNA分子,能序列特异性地切割靶RNA.与传统的蛋白质酶所不同的是,核酶通过两侧的引导序列与底物以碱基互补形成杂交链,具有更高的底物特异性;核酶切割完靶RNA后即从杂交链上解离下来,可对新的靶RNA进行切割.因此,核酸成为近年来基因治疗的一种新方法.锤头状核酶具有分子小、设计简单、易于合成的特点,人们对核酸在基因治疗中作用的研究大部分是采用锤头状核酸.我们以Forster等总结的由13个保守碱基和3个螺旋区组成的锤头状核酸为模型,选择大鼠c-myc癌基因mRNA为靶RNA,在计算机辅助下设计了能特异性切割大鼠c-myc癌基因mRNA的核酸.     

血管内皮生长因子165核酶的合成及其体外活性

目的 探讨抗血管内皮生长因子165（VEGF165）核酶的设计合成及其生物学活性。方法 利用计算机辅助设计针对VEGF165的锤头状核酶，构建核酶的自剪切转录载体pGEMRz212，体外转录合成核酶Rz212及其相应的底物VEGF165mRNA，在无细胞体系中观察核酶对靶RNA的切割作用。结果 构建的自剪切转录载体在转录的过程中发生了自身剪切，并释放出目的核酶Rz212，该核酶具有切割VEGF165 mRNA的作用。结论 计算机辅助设计的VEGF165锤头状核酶体外可有效切割靶RNA，具有较高的生物活性。     

核酶在肿瘤基因治疗中的应用

核酶(ribozyme)是一类具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地与靶RNA序列结合并加以切割，人工设计合适的核酶可实现对失控基因或有害基因表达的有效阻断，从而对疾病进行基因治疗。本文对核酶的结构与作用原理及核酶在肿瘤基因治疗中的应用作一综述。     

反义技术及其抗病毒作用

反义技术(antisensetechnique)是指根据碱基互补的原理,用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术[1]。包括反义RNA(asRNA)、反义寡聚核苷酸(asON)和具有核酸特异性切割活性的核酶(ribozyme)等。近年来的研究表明,反义?..     

乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响

惭型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。方法 利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶构建Ｒｚ１核酶自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１）,观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。结果 核酶自剪切转录载体体２上转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪     

“10～23”型脱氧核酶的研究进展

脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有酶活性的单链DNA分子。迄今为止，利用该技术已筛选出多种具有催化功能的脱氧核酶分子，其中研究最多的是具有RNA切割活性的脱氧核酶，尤其是10～23型脱氧核酶，该酶能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平使基因灭活，从而调控蛋白质的表达，在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景。     

核酶抗病毒、抗肿瘤作用的研究进展

核酶 ( Ribozyme)是一类独特的 RNA分子 ,具有自我剪切和催化性质 ,人们已成功地设计、合成了核酶 ,将其应用于抗病毒、抗肿瘤研究 ,并取得了很大的进展。现将核酶在这一方面的研究应用作一简要概述。核酶在肿瘤治疗中的作用1　核酶与癌基因　核酶独特的切割目的基因的方式有可能阻断癌基因的表达 ,从而逆转肿瘤细胞恶性增殖 ,并诱导其分化和凋亡。早在 1 992年 ,Kashami等采用核酶技术应用于人膀胱癌细胞系中 ,发现该肿瘤细胞的致病性和转移性均降低[1 ] 。近几年 ,国内一些机构也先后开展了这方面的工作。范毓东等研究发现切割 bcl-2m …     

锤头结构核酶在人肝癌细胞内对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

锤头结构核酶（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＨｈＲｚ）分子较小、结构简单、易于设计合成，已广泛用于抗病毒和抗肿瘤的研究。丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非编码区（５′ＮＣＲ）和核心（Ｃ）区高度保守，具有重要的生物学功能，是基因治疗选择的理想靶序列。５′ＮＣＲ有核糖体结合位点，以非帽依赖方式合成病毒蛋白，对病毒的复制、病毒蛋白的翻译和启动起重要的调节作用。我们以Ａｌｔ等［１］构建的ｐＣＭＶＮＣＲｌｕｃ载体为靶基因，应用计算机选择设计理想的锤头结构Ｒｚ，并通过脂质体介导的基因共转染方法，研究抗ＨＣＶ５…     

乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的构建

目的将重组丁型肝炎病毒基因组作为乙型肝炎病毒特异性核酶的载体,探讨解决核酶在实际应用中的保护性运载、靶向性和特异性问题。方法设计了乙型肝炎病毒特异性锤头型核酶结构,采用重组引物,结合“不对称ＰＣＲ”和“ＭｅｇａＰｒｉｍｅｒＰＣＲ”方法将所设计的锤头型核酶基因替代插入到了型肝炎病毒基因组５'端高变区,重组体经ＰＣＲ初步鉴定后,克隆到Ｔ载体（ｐＴＡｄｖ）Ｔ７启动子下游,经限制性内切酶酶切、序列测定分析。结果与结论证实该重组作为预期的乙型肝炎病毒特异性核酶－丁型肝炎病毒基因组重组体,为进一步的体外切割和细胞内与乙型肝炎病毒相互作用的研究提供了基础。     

成都地区部分人群血清中抗—HGV.IgG的检测

１９９５年初Ｋｉｍ等［１］报道了与人类肝炎有关的一种新型病毒，命名为庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）。同年，Ｌｉｎｎｅｎ等［２］经分子克隆及序列分析证实ＨＧＶ基因组全长约９４００个核甘酸，为正链单股ＲＮＡ病毒，属黄病毒科，ＨＧＶ与ＨＣＶ的同源性仅为２５％，说明...     

长链非编码 RNA 在肝癌中的研究进展

长链非编码RNA（long non－coding RNA,lncRNA）是一类长度超过200 nt 的RNA分子,它们缺乏特异性完整的开放阅读框（ open reading frame ,ORF）,没有或很少有蛋白编码功能［1］。在过去,人们一直认为lncRNA是无意义的转录副产物。然而,随着越来越多的研究,人们发现, lncRNA 参与了生物体内的多种调控,如 X 染色体沉默、转录激活或干扰、基因组印记及核内运输等,从而对生物体的生长、发育及死亡等过程发挥着重要作用［2－3］。于是lncRNA的研究也受到人们越来越多的重视和关注。肝癌（ hepatocellular carcino-ma,HCC）是临床上最常见的致死率高的恶性肿瘤之一。研究表明,许多lncRNA在肿瘤中的表达异常,并参与了癌症的发生和发展［4－5］,本文就近年来lncRNA在HCC研究方面取得的进展作一综述。     

丙型肝炎病毒核心基因靶向性M1GS核酶的构建及鉴定

目的 构建一种具有丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)靶向性的M1GS核酶,为进一步研究引导序列(guide sequence,GS)引导核酶P在RNA水平阻断HCV核心基因(core gene,C)的表达作前期基础.方法 选择HCV基因组中序列相对保守且在病毒复制过程中起关键作用的核心基因作为靶...     

抗HPV_(16)E_6核酶和抗HPV_(18)E_6核酶的设计与表达

以核酶（ribozyme）的锤头结构为模型，采用计算机软件针对HPV16R6、HPV18E6基因，设计了相应的ribozyme（简称抗16HR、抗18HR）。体外合成ribozyme基因后，克隆于带自身修剪功能的原核表达质粒pRG523中，构建成质粒pRG16HR、pGR18HR，为下一步研究抗16HR、抗18HR的体外活性和内效应，从而为探索以ribozyme治疗HPV相关性肿瘤的途经打下基础。     

抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用

目的: 设计合成血管内皮生长因子多位点核酶,探讨其对靶RNA的切割作用.方法: 利用计算机辅助设计针对VEGF165的3个单位点核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和联合型多位点核酶 (Rz123),构建其自剪切转录载体,观察多位点核酶对靶RNA的切割作用.结果: 构建的多位点核酶自剪切转录载体在体外转录中,顺式核酶发生了自身剪切,并释放出正确的目的核酶,多位点核酶可切割靶RNA,且效率高于单一核酶,其切割效率分别为 (37±10)% (Rz1), (51±8)% (Rz2 ), (68±15)% (Rz3) 和(88±11)% (Rz123).结论: 抗血管内皮生长因子多位点核酶体外可联合切割靶RNA,具有较高的生物活性.     

抗乙型肝炎病毒特异联合型核酶的体外切割作用

目的：探讨单一及多位点核酶对乙型肝炎病毒靶ＲＮＡ的切割作用。方法：利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶及特异联合型核酶,构建三个核酶各自及三个核酶串联的自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１２３）观察单一及串联核酶（Ｒｚ１２３）对靶ＲＮＡ的切割作用。结果：构建的串联核酶自剪切转录载体体外转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶ＲＮＡ,串联