大鼠心肌细胞急性分离方法

目的 探讨酶法分离大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素，提高细胞成活率和膜片钳实验成功率。方法 采用Langendorff灌流，先用无钙液灌流7-8min，再用含胶原酶P0.1-0.3g/L的酶液灌流8-10min，剪下心室肌组织，KB液中用吸管吹打分散，过150μm筛网，放置6-7h后进行膜片钳实验。结果 在分离细胞过程中，注意控制水、酶、温度、pH、O2等各种影响因素，可得到横纹清晰、膜良好、长杆状的心肌细胞。结论 仔细调整和控制细胞分离过程中的影响因素可以保证心肌细胞成活的数量和质量，有利于膜片钳实验的顺利进行。     

适用于膜片钳实验的犬心房肌细胞的分离方法分析研究

目的 建立稳定的成年犬心房肌细胞的分离方法,进行膜片钳实验的研究.方法 采用Langendorff灌流,台氏液灌流10 s后无钙台氏液灌流5 min, 125 U/ml胶原酶Ⅱ反复灌流消化约25～45 min,用无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心房肌组织,KB液中室温下剪碎,吹打,温育5 min后,用200 μm筛网过滤,室温静置,逐步复钙法复钙后,进行膜片钳实验.结果 分离的活性心肌细胞比率约90%, 形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整.结论 采用本方法可以获得高产量与高质量的适于膜片钳实验的成年犬心房肌细胞.     

适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究

目的：摸索并建立简便可行的适于做膜片钳实验的心肌细胞急性分离方法。方法：采用自行改进的Langendorff心脏灌流装置,用无钙台氏液和酶解液逆行主动脉灌流之后,剪取心肌组织置于KB液中保存以供全细胞膜片钳方式记录电流,结果：分离所得80％～90％的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的快钠电流。结论：控制好分离心肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。     

耐钙心肌细胞的分离及其L型钙通道电流观察

目的：建立大鼠心肌细胞分离方法，用于膜片钳实验，并记录L型钙通道电流，方法：基于Langendorff逆行主动脉灌流模型，以经改进的心肌细胞分离技术获得单个耐钙心肌细胞，用膜片钳全细胞方式记录L型钙电流。结果：在灌流所得50％存活单个心肌细胞中约70％为耐钙心肌细胞，并记录到典型的L型钙电流，结论：这种心肌细胞分离技术能获得大量具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞，可用于心肌细胞离子通道和信号转导机制的研究。     

大鼠心室肌细胞的分离及其钙电流的观察

目的：探讨大鼠心肌细胞酶急性分离的方法，并观察大鼠心室肌细胞膜钙电流。方法：采用Lngendorff灌流装置，用含胶原酶P(0．12g/L)的台式液，经主动脉逆行灌流心脏，分离心肌细胞；采用膜片钳全细胞记录的方法，观察记录大鼠心室肌细胞膜L型钙电流。结果：心肌细胞的存活率约70％-80％，形态呈长杆状，横纹清晰，膜良好。膜片钳全细胞记录出电压依赖性内向电流，其激活电位-30mV，最大激活电位0mV，反转电位50mV，并且此内向电流可被钙通道阻滞剂维拉帕米抑制。结论：用此法可分离出高存活率的心肌细胞，并具有正常的电生理特性。     

成年大鼠心肌细胞的急性分离方法探讨

目的:介绍一种可以稳定地获得高活性心肌细胞的急性分离方法,以便更有利于心肌细胞电生理研究和分子生物学研究.方法:用正常SD大鼠,麻醉成功后迅速取出心脏,以主动脉逆挂于Langendorff灌流装置上,先以无钙台氏液灌流5min然后换以酶液灌流20min,分次采集心肌组织获取心肌细胞并保存于KB液中.结果:获得大量高活性(78%±7.5%)的心肌细胞,杆状,轮廓和横纹清晰,折光性好.结论:本文介绍的方法稳定性好,获得的心肌细胞数量多,活性好,适合用于心肌细胞电生理和分子生物学研究.     

大鼠肥厚心肌细胞分离方法的探讨

目的探讨适用于膜片钳实验急性分离肥厚耐钙SD大鼠心室肌细胞的方法。方法利用自制Lan-gendorff灌流装置,采用四步法获得单个耐钙心肌细胞,以适用于膜片钳离子电流的记录。结果稳定获得30%~40%肥厚耐钙心肌细胞。结论按照本方法在心肌细胞分离过程中的介绍,能获得30%~40%肥厚耐钙心肌细胞。     

心肌细胞分离方法的改进及其钾电流的观察

目的:探索建立简单可靠的心肌细胞的酶解分离方法,提高细胞存活率和膜片钳实验成功率.方法:采用Langendorff装置,无钙液和胶原酶P二步灌流法分离心肌细胞.显微镜下观察细胞形态结构,并应用膜片钳全细胞技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流.结果:心肌细胞存活率高,形态结构良好,可成功记录出瞬时外向钾电流.结论:通过改进的分离方法获得的心肌细胞存活率高,具有正常的电生理特性.     

乌拉地尔对大鼠心肌细胞膜L-型钙通道电流的影响

目的观察乌拉地尔对大鼠心肌细胞膜L-型钙通道电流（ICa-L）的影响。方法急性分的SD大鼠心肌细胞随机分为3组（n=6）：乌拉地尔组（A组）、乌拉地尔复合美西麦角组（B组）和美西麦角组（C组）。经台氏液灌流1min（T1）后，A、C组分别用含0．4／μmol／L乌拉地尔、40nmol／L美西麦角的台氏液灌流1min（T2）；B组先用含0．4μmol／L乌拉地尔的台氏液灌流1min（T2），然后用含40nmol／L美西麦角的台氏液灌流1min（L），之后三组均再用台氏液灌流1min（T4）。用全细胞膜片钳技术记录T1-4。时ICa-L峰值。结果与TI比较，三组T2时ICa-L峰值降低（P〈0．05），T4时ICa-L峰值差异无统计学意义；B组T3时ICa-L峰值降低（P〈0．05）；B组T3时ICa-L峰值低于T2（P〈0．01）。结论乌拉地尔可抑制大鼠心肌细胞ICa-L，可能与5-HT1A受体无关。     

成年小鼠心室肌细胞分离及L型钙电流记录

目的:寻找一种成年小鼠心肌细胞分离的简便、可行且稳定的方法,以获得耐钙心肌细胞并记录心室肌细胞L型钙电流(IL-Ca)。方法:采用Langerdorff逆行主动脉灌流、无钙台氏液+胶原酶Ⅱ消化法分离成年小鼠单个心室肌细胞;利用含钙细胞外液复钙法筛选耐钙心肌细胞;并采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞L型钙电流。结果:利用该方法分离心肌细胞可获得90%活细胞;复钙后细胞存活率60%-70%;并可记录到典型L型钙电流。结论:无钙台氏液+胶原酶Ⅱ消化法简单可行且稳定,可分离大量活性较佳且耐钙心肌细胞,可用于心肌细胞离子通道电流记录,从而为心脏电生理研究提供有力的技术支持。     

膜片钳技术研究中钙耐受的心室肌细胞分离方法

目的：探索并建立适合于膜片技术研究的心室肌细胞急性酶分离方法。方法：采用改进的自制的Langendorff心脏灌流系统,用无钙Tyrode液和酶解液逆行主动脉灌流之后,分次剪取心肌组织置于细胞保存液（KB液）中保存以供全细胞膜片钳方式记录膜电位和膜电流。结果：分离所得80%-90%的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的动作电位。结论：控制好分离心室肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心室肌细胞的重要因素。     

一种有效记录人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流的方法

目的：探讨一种有效的记录人心房肌细胞小电导钙激活钾通道（small conductance Ca2＋-activated K＋channels,SK）电流的全细胞膜片钳方法。方法：以人心房肌细胞为研究对象,采用传统全细胞膜片钳技术,记录人心房肌细胞的小电导钙激活钾通道的宏观电流。传统全细胞模式形成后,分别记录在浴液中加入apamin（100 nM）前后的电流,两者相减就得到了apamin敏感的SK2的电流。结果：采用传统全细胞膜片钳技术,能有效记录人心房肌细胞上apamin敏感的宏观电流。该电流是内向整流,去极化激活时,无明显失活现象,无尾电流出现,这些都符合SK2电流特性。结论：本实验提供了一种简单、有效的记录人心房肌细胞SK2宏观电流的方法,为今后深入的研究提供了实验基础。     

新生大鼠心肌细胞培养及电生理特性观察

目的应用原代细胞培养技术,以获取大量具有正常电生理特性的心肌细胞。方法用胶原酶溶液处理1 d龄SD大鼠的心脏,差速贴壁法纯化获得的单个心肌细胞,CO2培养箱中培养8 d后,以膜片钳技术记录心肌细胞的动作电位和各跨膜离子流。结果细胞培养中,改进了酶溶液的成分、浓度和经典的差速贴壁法作用时间,获得了大量的高纯度单个心肌细胞。在此细胞上,采用电流钳技术,可引导出心室肌动作电位。运用心肌细胞离子通道的电压依赖性和特异阻断剂,在不同的钳制电位和指令电位下,可记录到INa,ICa,Ito,IK等多种离子流。结论改进的细胞培养技术可获得大量的具有正常电生理特性的心肌细胞。     

不同用途的心室肌细胞的分离

目的 :建立适合于不同用途的心室肌细胞的酶解分离方法。方法 :恒流 Langendorff灌流 ,I型胶原酶酶解分离 ,应用膜片箝技术记录离子电流、双波长显微荧光光度术检测细胞内游离钙离子浓度及视频跟踪系统测定心肌单细胞收缩。结果 :采用不同分离技术参数获得的心肌细胞能满足上述三种实验条件下的要求。酶解分离的单个心室肌细胞静息电位为 (- 74 .0 6± 4 .5 4 ) m V,记录到心室肌细胞典型的钾、钠、钙离子电流和稳定的心室肌细胞内游离钙比值 ,心室肌单细胞收缩特性稳定。结论 :通过调整分离技术参数获得的心室肌细胞性能稳定 ,具有正常的电 -机械生理特性和耐钙性。     

多用途成年大鼠心室肌细胞分离方法

目的 建立稳定的可同时用于细胞培养和膜片钳实验的成年大鼠心室肌细胞的分离方法 .方法 应用Langendorff灌流.生物酶消化法分离耐钙心肌细胞.分别用左右心室肌做细胞培养和全细胞膜片钳研究.结果 左室心肌细胞数(3.7±0.6)× 10~6,杆状细胞得率(84.85±2.7)%.右室心肌细胞横纹清晰,折光率好,膜片钳实验时容易封接破膜,记录到典型的I_(Ca).L、I_(K1)、I_(to)、I_(Na)电流.结论 该方法 简单、节约、重复性好,改善了杆状细胞得率、细胞质量,左右心室肌细胞分别能很好地用于细胞培养和膜片钳实验.     

急性分离大鼠心房肌细胞方法的改进及对钾、钠、钙电流的记录

目的:介绍1种改进的成年SD大鼠心房肌细胞分离方法.方法:SD大鼠麻醉后,快速取出心脏,将主动脉结扎在Langendorff灌流装置上,无钙台式液灌流5 min后换用酶液灌流10～12 min,剪取心耳组织于KB液中剪碎并吹打,200目细胞筛网过滤,将细胞滤液500 r离心2 min,梯度复钙后将细胞悬液置于4℃冰箱中...     

丹参注射液对模拟缺血预适应引起兔心室肌细胞动作电位和ATP敏感性钾电流变化的影响

目的:探讨丹参注射液对模拟缺血预适应引起兔心室肌细胞动作电位和ATP敏感性钾电流(IK(ATP))变化的影响,试图揭示其保护心肌缺血-再灌注损伤,抗缺血性心律失常作用的离子机制。方法:采用酶解法分离兔左心室细胞,按先后顺序,用正常Tyrode液和模拟缺血液以及模拟缺血液加丹参(750 mg.L-1)灌流,利用膜片钳全细胞记录技术记录不同条件下动作电位和IK(ATP)前后变化。结果:①模拟缺血液灌流后动作电位时程(APD)复极化的50%(APD50)和90%(APD90)分别缩短(与正常组相比P<0.05,n=12);模拟缺血液加丹参灌流,APD50和APD90缩短更加明显,分别缩短了80.46%和71.87%(与正常组相比P<0.01,与模拟缺血液组相比P<0.05,n=12)。静息电位和动作电位幅值无明显改变;②经模拟缺血液灌流,引起IK(ATP)通道的开放,膜电流显示外向性直线形,发生率为58.33%(7/12,P<0.05)。模拟缺血液加丹参,更容易引起IK(ATP)开放,膜电流曲线完全成为直线,诱发率为91.67%(11/12,与正常组和模拟缺血液组相比P<0.05);③Glibenclimide能使这种外向性直线形膜电流恢复为“N”形,证明这种膜电流为IK(ATP);经丹参作用后,改用正常Tyrode液冲洗,心肌细胞上结合的丹参可以被洗脱以及从模拟缺血液中得到恢复。结论:丹参能产生类似心肌缺预适应的病理生理过程,起到了ATP敏感性钾通道开放剂效应,这可能是丹参对心肌缺血预适应的保护作用具有增强效应电生理基础。     

动脉平滑肌细胞膜片制作及其大电导钙激活钾通道的特性

目的: 探讨人体小动脉平滑肌细胞膜片制作方法,观察其上大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activatedpotassium channels,BK_Ca)的特性。方法: 将新鲜分离出的人肠系膜动脉,分离出平滑肌层,经酶解得单个平滑肌细胞。取平滑肌细胞置于含对称性高钾(K+140 mmol/L)浴液中,用膜片钳技术记录其单通道电流,输入计算机进行数据采集与分析。观察动脉平滑肌细胞三种膜片的制作过程和BK_Ca的特性。结果: 在肠系膜动脉平滑肌细胞膜上分别形成了细胞贴附式、内面向外式、全细胞记录三种膜片。用膜片钳技术观察到急性酶分离的人体肠系膜动脉平滑肌细胞上BK_Ca通道具有钙敏感性:表现为胞内游离钙离子浓度增加,通道开放事件数目增加;电压依赖性:表现为随着膜电位的增加,通道开放事件数逐渐增加;电导值大:本实验的电导值为198.6±38.09 pS;应用TEA+为50 mmol/L时通道活动完全阻断。结论: 人体肠系膜动脉平滑肌细胞上BK_Ca通道具有钙敏感性、电压依赖性、大电导、TEA+敏感特性。     

单个人心房肌细胞急性分离技术及其细胞膜瞬时外向钾电流的记录

目的建立单个人心房肌细胞的急性分离技术,以满足检测人心肌细胞离子通道的需要。方法两步酶解法消化分离人心房肌细胞,采用膜片钳全细胞技术记录瞬时外向钾电流（I_to）。结果根据患者的性别、年龄及组织块的大小,选择适当的消化时间,分离得到结构清晰,横纹清楚,边缘整齐,少颗粒,舒展伸直,呈长杆状的单个心肌细胞：采用全细胞膜片钳技术能记录到瞬时外向钾电流。结论该方法能分离到形态和状态均良好的细胞,有利于进行单个人心房肌细胞膜片钳实验的研究。