一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法.方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,通过MGMT基凶甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较.结果 改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物.结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果 改良法对于低至15、625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物，而传统法对于62．5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度，该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。     

改良的甲基化特异PCR法在人宫颈癌Hela细胞检测中的应用

目的介绍一种CpG岛甲基化分析方法，即甲基化特异PCR法（methylation—specific PCR，MSP）以及对该方法的改良。方法用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后，进行甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，并对MSP法进行改良。应用该法分析人宫颈癌Hela细胞中RASSF1A、p16基因5＇CpG岛甲基化状态。结果发现人宫颈癌Hela细胞中有RASSF1A、p16基因的甲基化，改良后的MSP更容易获得较好的效果。结论MSP法是一种较为简便、灵敏和具特异性的甲基化检测方法，改良后该方法更加简便可行。     

p16基因甲基化特异检测方法的建立及其初步应用

目的：建立p16基因中CpG岛的甲基化分析方法，即甲基化特异的PCR（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）方法及其初步应用。方法：用亚硫酸氢钠修饰变性后的被测DNA，随之进行甲基化，非甲基化特异的PCR扩增。应用MSP法分析白血病患者的白细胞p16基因5'CpG岛的甲基化变异情况。结果：用加热法变性DNA，亚硫酸氢盐修饰DNA,Wizard DNA纯化树脂除盐，纯化修饰后的DNA都获得了成功，并建立了MSP分析p16基因甲基化的方法。白血病患者的白细胞p16基因的5'CpG岛有一定比2例的甲基化变异。结论：MSP是一种较为简便，敏感，且具有高度特异性的检测任何基因的CpG区域甲基化位点的分析方法。     

基于错配杂交化学发光定量检测MGMT基因过甲基化简

目的 利用错配杂交和化学发光技术,建立一种检测MGMT基因启动子区过甲基化的定量分析方法.方法 基因组DNA经过亚硫酸氢钠修饰,所有未甲基化的胞嘧啶都被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化.设计特异的PCR引物（不合CpG位点）,同时扩增含有CpG位点甲基化或非甲基化目的MGMT基因启动子区,用两条分别与甲基化及非甲基化CpG位点互补的寡核苷酸探针与扩增产物杂交,化学发光检测,通过两条探针的杂交信号强度之比确定样品DNA中MGMT甲基化的程度.结果 检测混合样品中MGMT基因的甲基化水平与结果完全相符,并可用于肿瘤组织样品的MGMT甲基化定量检测.结论 与现有方法相比,本法是一种检测快速、操作简便的MGMT基因甲基化的定量检测方法.     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。     

巢式PCR法检测不同类型标本中p16基因启动子过甲基化

目的 介绍一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法，即巢式甲基化特异性。PCR法(nested-MSF，nMSP)，探讨该方法最佳应用条件，并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链，用亚硫酸氢盐修饰单链DNA，所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物，进行巢式PCR扩增，最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子的甲基化，比普通的甲基化特异性PCR法具有更高的灵敏度。结论 巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法，可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

基于错配杂交化学发光定量检测MGMT基因过甲基化

目的利用错配杂交和化学发光技术,建立一种检测MGMT基因启动子区过甲基化的定量分析方法。方法基因组DNA经过亚硫酸氢钠修饰,所有未甲基化的胞嘧啶都被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化。设计特异的PCR引物(不含CpG位点),同时扩增含有CpG位点甲基化或非甲基化目的 MGMT基因启动子区,用两条分别与甲基化及非甲基化CpG位点互补的寡核苷酸探针与扩增产物杂交,化学发光检测,通过两条探针的杂交信号强度之比确定样品DNA中MGMT甲基化的程度。结果检测混合样品中MGMT基因的甲基化水平与结果完全相符,并可用于肿瘤组织样品的MGMT甲基化定量检测。结论与现有方法相比,本法是一种检测快速、操作简便的MGMT基因甲基化的定量检测方法。     

应用降落PCR及克隆测序检测2型糖尿病外周血白细胞胰岛素样生长因子受体IGF1R基因甲基化

目的:比较应用降落PCR(TD-PCR)及克隆测序检测2型糖尿病患者外周血白细胞中胰岛素样生长因子受体(IGF1R)基因启动子区DNA甲基化位点的方法。方法:提取2型糖尿病患者外周血白细胞DNA进行亚硫酸氢盐处理,设计引物扩增IGF1R基因启动子区富含CG位点序列,分别行普通PCR和TD-PCR扩增,对含目的条带产物进行直接测序和克隆后测序。结果:与普通PCR扩增结果相比,TD-PCR扩增条带清晰、产物量多、二聚体少;且TD-PCR减少了对退火温度不断摸索的过程。克隆后测序峰图清晰,碱基丢失错判频率减少。结论:推荐应用TD-PCR检测亚硫酸氢盐处理的DNA甲基化位点,并进行克隆后测序。     

石蜡包埋组织中DNA甲基化特异性PCR技术

目的 以石蜡包埋组织提取的DNA为模板进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测,研究其可行性.方法 35例石蜡包埋肺癌组织DNA样品制备和亚硫酸氢盐修饰后进行MSP扩增检测.结果 石蜡包埋组织MSP检出率与文献采用新鲜组织标本报道一致.结论 MSP通过选择合适的实验条件,可适用于石蜡包埋组织DNA甲基化分析.     

包裹质粒DNA及线状DNA脂质体的制备

本实验制备组成分别为DOPE/Chol/OA(4:4:3)的酸敏脂质体及DOPC/Chol/OA(4:4:3)脂质体,用于包裹质粒pSV_2-neo、pUC18-ras、pSV-neo-ras及大分子线状DNA,包裹率可达50％.被脂质体包裹的DNA不被DNase降解,提示DNA分子被脂质体包裹在微球体内部.电泳检测表明,被包裹的DNA分子没有断裂.所得到的脂质体较稳定,4℃放置5～6月,脂质体内仍保留部分DNA分子.制备酸敏脂质体时,pH为8.0时脂质体较稳定,pH<6.5～7时则不稳定.     

DNA甲基化的生物学意义及其检测方法

DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制，参与细胞分化与增殖、生物体老化、肿瘤发生等多种重要生命活动。文章简要叙述了DNA甲基化异常的病理学意义，分类介绍了目前主要的甲基化检测方法。希望对相关领域的研究有所助益。     

基于DNA折纸的DNA复制的单分子检测和表征

目的探索DNA复制的单分子检测和表征途径。方法单链DNA模板链的两端通过碱基互补配对固定在DNA折纸纳米
结构上,利用原子力显微镜（AFM）在单个DNA分子水平上对复制过程中的DNA分子的不同阶段进行检测和表征,其中包括：
复制前后的形貌,复制过程中大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow Fragment片段（KF）的分布,以及复制后Biotin-Streptavidin（BA）
分子识别反应在单个DNA链上所引起的进一步形貌变化。同时,采用常规的琼脂糖凝胶电泳方法分析DNA复制前后的变化
情况。结果（1）DNA模板链成功连结在三角折纸的特定位点,连接效率达到50%以上;（2）DNA复制过程中,KF结合在DNA
模板链上,复制后KF从DNA链脱离;（3）复制前后DNA链高度变化明显,DNA链高度增加了约0.7 nm;（4）复制后,当加入
Streptavidin时,其结合于含有Biotin标记的新合成DNA链位置处,形成BA复合物,平均高度达到约4.9 nm;（5）琼脂糖凝胶电
泳结果也显示单链DNA变为双链,以及双链DNA分子上结合的BA复合物。结论通过将AFM与DNA折纸技术相结合,可实
现单分子水平上的DNA复制的检测和表征,此方法将有助于研究DNA聚合酶的作用机制以及不同因素对DNA复制的影响。
     

DNA适体筛选中双链DNA拆分方法研究

目的研究能够用于DNA适体筛选的双链DNA拆分方法。方法采用琼脂糖凝胶电泳,观察和比较λ核酸外切酶法、不对称PCR法、磁珠法以及琼脂糖凝胶法的拆分效果。结果琼脂糖凝胶电泳显示,λ核酸外切酶法不能充分拆分双链DNA形成单链DNA;不对称PCR法产生的非特异性单链DNA较多;磁珠法拆分双链DNA获得单链DNA的量较低,且成本较高;琼脂糖凝胶法拆分双链DNA较为充分,单链DNA纯度较高。结论琼脂糖凝胶法可用于DNA适体筛选中双链DNA的拆分。     

DNA的电化学分析

由电化学构建的DNA检测器或生物传感器往往比较容易实现微型化、集成化及原位、在体、实时、在线的检测。现着重对DNA的电化学传感器的原理、检测方法及其发展趋势进行评述。     

DNA改组及其应用

DNA改组是一种改造基因和蛋白的有效实验进化技术。DNA改组技术在医药、疫苗、农业、生物治疗、兽药研究、营养、人类基因治疗、生物武器的研究等重要领域都具有广阔的应用开发前景。本文综述了DNA改组的技术及其在疫苗方面的应用展望。     

恙虫病立克次体DNA及DNA序列测定

目的:检测39例不明原因发热患者血液中恙虫病立克次体DNA。方法:用NPCR检测恙虫病立克次体DNA,取其DNA提取物进行DNA序列分析。结果:序列分析表明扩增的片段为立克次体DNA片段。39例不明原因发热患者血液用NPCR法检出13例恙虫病立克次体DNA。占不明原因发热患者的33.3%。结论:NPCR法可以快速检出恙虫病立克次体DNA,可用于恙虫病的临床早期诊断。     

氯乙烯致DNA损伤与DNA修复基因甲基化

目的探讨氯乙烯职业接触的早期效应DNA损伤与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因MG-MT、错配修复基因hMLH1启动子甲基化的关系。方法氯乙烯接触工人按淋巴细胞双核微核数分为DNA损伤组(72例)和非损伤组(43例),采用甲基化特异的PCR法检测修复基因的甲基化。结果hMLH1基因在DNA损伤组和非损伤组均未检测到甲基化,MGMT基因在DNA非损伤组未检测到甲基化,在DNA损伤组MGMT发生甲基化频率为6.9%(5/72)。结论在氯乙烯致DNA损伤阶段,可检出MGMT基因甲基化异常。