小鼠PPARγ2基因表达载体pcDNA3-PPARγ2的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（mPPARγ2）基因载体pcDNA3-PPARγ2进行体外转化和扩增,为基于PPARγ2的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-PPARγ2质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-PPARγ2质粒其A260/A280=1.89,浓度为420 ng/μl。结论成功转化并扩增了pcDNA3-PPARγ2质粒,为PPARγ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体。     

p185胞外区基因表达载体的构建

目的 获得p185胞外区基因并与载体相连接,构建重组质粒。方法 从过度表达p185 r NIH3T3-erbB2细胞中提取总RNA,以特异性引物逆转录合成cDNA,再通过PCR扩增出目的基因片断,经酶切后与质粒载体组成重组质粒。用此重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue,在含氨苄青霉素的LB培养基上培养,挑取阳性克隆并鉴定。结果 得到了带有p185胞外区基因的重组质粒。结论 通过逆转录PCR扩增和基因重组到载体pQE40而成功地得到p185胞外区基因表达载体。     

波形蛋白干扰质粒shRNA Vim的构建及鉴定

目的以波形蛋白基因为靶基因,构建波形蛋白干扰质粒shRNA Vim并验证其干扰效果。方法根据GenBank中大鼠波形蛋白的mRNA序列设计shRNA序列,插入至pSilencer 4.1载体,构建重组质粒,转化到Top 10感受态细胞,经氨苄青霉素筛选挑取阳性克隆并进行测序分析。结果 DNA测序分析显示干扰质粒shRNA Vim构建成功,免疫印迹法显示该干扰质粒能有效地抑制波形蛋白的表达(P<0.001)。结论成功构建波形蛋白干扰质粒shRNA Vim,为研究波形蛋白的生物学功能打下基础。     

大量提取质粒的简便方法

0　引言　质粒提取是分子生物学实验室一项最基本的工作 .我们介绍一种非常简便的大量提取质粒方法 ,此法提取的质粒可直接用于酶切鉴定、转化、探针标记等 .菌种为转化了重组 p U C19质粒的 DH5α E.coli.重组 p UC19质粒为在 H inc II位点插入不同的 PCR产物连接而成 .1　方法　挑一个单菌落接种于 5 m L L B/ Amp(含氨苄青霉素0 .1g· L-1 )培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,转 1m L菌液于 10 0 m L L B/ Amp培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,将菌液倒入两个 5 0 m L离心管 ,10 0 0 0 g离心 2 min,弃去上清 ,沉淀中加入 4…     

一种快速筛选和鉴定重组体的方法——改良菌落PCR

在对DNA片段进行亚克隆的实验中,阳性重组子的筛选是鉴定外源DNA是否插入载体的重要步骤。常用的方法有两种:一是在含抗生素的平皿上挑取转化生长的单菌落,经液体培养基扩大培养后,提取质粒,再经酶切或PCR扩增鉴定;另外,还可以用菌落原位杂交的方法进行初筛。这两种方法虽然可靠,但是步骤复杂繁琐,而且后一种方法还存在污染问题。我们在构建重组毒素表达载体时,摸索出了一种改良的菌落PCR扩增筛选法,既准确又简易,现介绍如下。     

Stx2A-LHRH重组质粒的构建及分析

目的 :表达志贺毒素 2 A-黄体生成激素释放激素 ( Stx2 A- LHRH)重组毒素 ,探讨其是否具有特异杀伤癌细胞的可能性。方法 :用 PCR方法扩增带有 Nco 和 Eco R 酶切位点的 Stx2 A-LHRH DNA基因 ,克隆至 p ET- 2 0 b( + )质粒中 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,挑取单菌落培养 ,提取质粒、酶切。结果 :经鉴定、测序 ,获得重组质粒 p ET2 0 - SL。结论 :利用分子生物学技术成功地构建了带有 Stx2 A- LHRH重组毒素基因的质粒 ,使其表达 Stx2 A- LHRH重组毒素成为可能 ,为进一步研究导向药物奠定了基础。     

A型流感病毒株核蛋白基因的克隆与重组质粒的构建

目的克隆A型流感病毒株Swine/Henan/703/2001(H3N2)的核蛋白(NP)基因序列并构建重组质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术从病毒株基因组中扩增出编码核蛋白的基因序列,克隆至pGEM-TEasy载体,经蓝白筛选、菌落PCR及酶切鉴定挑取阳性克隆并测序。结果利用RT-PCR扩增到目的基因片段,并将其克隆至T载体。结论成功构建重组质粒pGEM-TEasy-NP,为NP相关功能及流感疫苗的进一步研究奠定实验基础。     

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建

目的 探索pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建.方法 在体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,将pTAT-XIAP质粒转化至DH5α.堵养筛选成功转化子,提取纯化质粒,电泳鉴定.结果 pTAT-XIAP质粒在含氨苄青霉素的LB固体培养基上呈分散菌落生长,在无氨苄青霉素的LB固体培养基上成片生长,未经质粒转化的DH5α感受态细胞在含氨苄青霉素的LB固体培养基上未见菌落生长.电泳结果 显示pTAT-XIAP质粒约4500bp,pTAT-HA质粒约3000 bp,条带大小与质粒图谱一致.结论 将大鼠XIAP基因插入PTAT-HA质粒,成功构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体.     

EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建

①目的 构建携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体.②方法 根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点;常规培养B95-8细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定,证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体.凝胶回收双酶切产物BARF1片段,再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his,转化E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析,确认插入方向.③结果 以B95-8细胞提取RNA进行RT-PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1,得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后,证实目的 基因BARF1片段已插入pUM-T载体,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体.④结论 成功地构建真核表达载体.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.     

FXR2酵母双杂交饵载体的构建及酵母菌转化

目的构建FXR2酵母双杂交系统的“饵”质粒，并转化酵母菌，为筛选FXR2P互作蛋白作基础。方法提取pMD18-T—FXR2，酶切后将FXR2基因连接到MATCHMAKER LexA Two—Hybrid System中的plexA质粒上，得到“诱饵”(Bait)-plexA—FXR2，导入大肠杆菌扩增，筛选阳性克隆并提取重组Bait质粒，再转入酵母菌EGY48(p8op—lacZ)。结果通过遗传学方法筛选得到构建成功的plexA—FXR2；通过营养缺陷筛选，证明Bait重组质粒转入酵母菌中。结论成功构建Bait质粒并使酵母菌转化。     

含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的：制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法：设计引物PCR扩增野生型p53cDNA，用T－A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109，提取pGEM-T/p53重组体，双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109，筛选pL(p53cDNA)SN重组体，脂质体法转染包装细胞AM12，G－418（geneticin)筛选，收集病毒液。结果：通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆，收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论：含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。     

人巨细胞病毒p52蛋白基因的克隆及表达

制备人巨细胞病毒Ｐ５２蛋白特异性抗原。方法用ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶＰ５２蛋白ＩｇＭ抗原决定簇编码区ＤＮＡ片段，克隆表达载体ＰＢＶ２２０中，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ株，用氨苄青霉素抗性和质粒酶切图谱分析法筛选阳性克隆，经温控诱导基表达。     

酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S1相关蛋白的研究

目的　利用酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前 S1 (pre S1 )蛋白相关蛋白 ,以利于探讨前 S1 蛋白在乙型肝炎病毒的入胞机制。　方法　以 HBV DNA阳性血清为模板通过PCR法扩增含 Eco R 与 Pst 酶切位点的 pre S1 基因序列 ,p AS2 - 1载体及 pre S1 基因 PCR产物经双酶切并连接 ,转化到大肠杆菌 JM10 5 ,对重组质粒 p AS2 - 1- pre S1 进行序列测定。乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌 AH 10 9,以Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。将p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞 ,通过选择性培养、L ac Z活性测定筛选阳性菌落 ,分离实验及交合实验排除假阳性 ,PCR扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定 ,结果提交 NCBI的 BL AST应用程序 ,在Gene Bank 数据库查询其同源序列。　结果　重组质粒p AS2 - 1- pre S1 经序列测定含有完整的 pre S1 基因片段 ,Western Blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的pre S1 - BD蛋白 ,p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞后 ,在 5× 10 6 转化子中 ,经选择性培养共长出 97个菌落 ,17个为 L ac Z阳性菌落 ,分离实验及交合试验筛选出 1个阳性菌落 ,PCR扩增产物经 Gen Bank数据库查询与人类初期多肽相关复合体 α     

酵母双杂交筛选雄激素受体辅助调节因子267-α(ARA267-α)的相互作用蛋白

目的:通过酵母双杂交系统筛选与雄激素受体辅助调节因子267-α(androgen receptor-associated coregulator 267-α,ARA267-α)有相互作用的蛋白质,为研究ARA267-α的生理功能寻找证据和方向.方法:以能表达ARA267-α中4个PHD(p1ant homeodomain)和1个SET[Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste,Trithorax]结构域的pGBKT7-PHD-SET重组质粒为"诱饵",采用酵母融合(yeast mating)方法筛选预转化的人脑cDNA文库.挑选阳性酵母菌落进行质粒提取、限制性内切酶分析和DNA测序.将测序结果在GenBank中进行核苷酸序列同源性比对,确定它们所对应的基因.通过再次酵母双杂交排除假阳性相互作用.结果:筛选cDNA文库共获得约600个阳性酵母菌落,随机挑选其中的65个菌落提取混合质粒.经过在氨苄青霉素培养盘中筛选,共得到43个文库pACT2-cDNA质粒.选取35个酶切片段不同的文库pACT2-cDNA质粒进行测序,测序结果比对揭示,35个cDNA插入片段来源于16种不同的基因.酵母双杂交证实其中RanBPM是ARA267-d的假阳性作用蛋白.结论:通过筛选cDNA文库发现ARA267-α可以与多个不同的蛋白质相互作用,这提示ARA267-α可能是一个具有多种生理功能的蛋白分子,而RanBPM极可能是一个转录因子.     

细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒

目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含hp2 7mt基因的重组腺病毒质粒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,构成穿梭质粒 pShuttle -CMV/hp2 7mt;然后再用经PmeI酶切的 pshuttle-CMV/hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy - 1 /hp2 7mt;筛选同源重组质粒阳性克隆 ,提取pAdeasy - 1 /hp2 7mt质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果 :线性化的pShuttle-CMV/hp2 7mt转化含pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,1 2 - 2 0h后获得了30 %阳性重组质粒克隆 ,经酶切获得一大于 2 0kb的大片段和 3 .0kb的特征性片段 ,PCR反应扩增出了 2 75bp的片段 ,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp2 7mt。 结论 :用细菌内同源重组法可制备含hp2 7mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷。为转染 2 93细胞制备高滴度重组腺病毒提供高纯度的重组腺病毒质粒     

PCR在消减文库构建中的应用

目的 :消减文库构建过程中 ,用PCR技术快速筛选重组阳性克隆。方法 :将白色单菌落加入氨苄抗性LB培养液中 ,37℃摇振培养过夜 ,取细菌悬液作PCR模板。结果和结论 :以PCR方法筛查重组阳性克隆 ,可以简便快速鉴定重组阳性克隆 ,不需提取质粒。筛选重组阳性克隆可直接用细菌悬液作PCR模板 ,在消减文库构建时 ,能大大提高工作效率。     

rhIL-12逆转录病毒双亚基共表达载体的转化和鉴定

目的以人白细胞介素-12（IL—12）双亚基共表达载体pL35P40SN转化大肠杆菌DH5α，并对转化载体进行鉴定。方法以构建好的IL-12双亚基共表达载体pL35P40SN及其对照载体pLXPXSN转化大肠杆菌DH5α，氨苄抗性平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒并对其进行酶切及PCR鉴定。结果以XhoI酶切后鉴定，对照载体和IL-12共表达载体的条带分别在6490bp和8800bp的位置，以IL-12p35和P40引物PCR扩增后电泳鉴定，在700bp和1000bp处可见清亮电泳条带。结论含IL-12p35和p40双亚基基因的pL35P40SN载体成功转入大肠杆菌DH5α，经多项鉴定结果正确。为以其转染细胞并对IL-12的功能研究打下良好基础。     

重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定

目的 构建重组人HIF-1α真核表达载体质粒，为进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究做准备。方法 从血细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B1与T载体连接后转化大肠杆菌JM109，LB平板培养基筛选菌落，提取质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4／HisMaxA载体。结果 获得重组的人HIF-1α真核表达载体质粒，经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，插入pcDNA4／HisMaxA载体部位正确。结论 重组人HIF-1α所选用的pcDNA4／HisMax可高表达目的基因，为利用其进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定了基础。     

人生物素基因的原核表达及纯化

目的构建生物素原核表达载体，获取同源性、可溶性、高纯度的重组生物素融合蛋白，为生物素的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从胃癌细胞中提取RNA，经RT-PCR扩增，克隆出生物素基因；用BamHⅠ和HindⅢ对生物素DNA和载体pET32进行双酶切，构建pET32．生物素重组质粒；将重组质粒转化BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落，经DNA测序及BLAST比对，确认生物素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向；用IPTG诱导表达，Western-Blotting鉴定。用Ni2＋金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白。结果通过RT-PCR。经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的生物素DNA片段与预期大小一致。经双酶切及DNA测序鉴定，生物素DNA定向插入了pET32质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白。经Western．Blotting鉴定。所诱导的蛋白为重组生物素融合蛋白。结论成功构建了生物素基因原核表达载体，表达和纯化了生物素融合蛋白。     

PCR法直接筛选重组阳性克隆

目的　建立一个简便、可靠的重组阳性克隆的筛选方法。方法　应用扩增小鼠生精细胞凋亡相关基因时使用的引物 ,以基因重组扩增后得到的菌落为模板 ,直接进行PCR扩增。结果　在筛选的阳性菌落中可扩增到与小鼠凋亡相关基因片段大小一致的阳性条带 ;以阳性克隆提取质粒进一步进行PCR和酶切鉴定及序列分析 ,证明结果正确。结论　菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效的筛选重组阳性克隆的方法。