肿瘤坏死因子-α高亲和噬菌体融合肽的筛选及分析

目的 应用噬菌体展示随机肽库技术,进行肿瘤坏死因子-α(TNF-α)高亲和肽的筛选研究.方法 以重组人TNF-α为靶标分子,对噬菌体展示环七肽库进行3轮亲合筛选,ELISA结合实验鉴定阳性克隆,对获得的阳性克隆进行DNA序列测定,推导短肽的氨基酸残基序列.结果 3轮筛选后,随机挑取的15个噬菌体克隆中7个可与TNF-α结合.测序发现这7个阳性克隆融合多肽中的序列完全一致,均为STPTRYS.结论 筛选到一个可与TNF-α高亲力结合的噬菌体多肽,该肽序列能否阻断TNF-α的活性有待进一步阐明.     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

运用噬菌体展示随机肽库筛选与内毒素结合的高亲和性多肽

目的 从噬菌体展示随机肽库中筛选与内毒素结合的多肽序列,并进行鉴定.方法 以内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为靶分子对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮亲和筛选,获得与LPS结合的噬菌体克隆,应用结合实验和克隆斑抑制实验进一步确证.挑选结合力强的克隆进行DNA测序,推导出呈现的多肽序列,应用生物信息学软件进行多肽序列分析和同源性分析.结果 经4轮亲和筛选从噬菌体展示随机十二肽库中筛选获得了86个克隆,挑选12个结合力强的克隆进行DNA序列测序及生物信息学分析,结合本项目组的噬菌体展示随机七肽库筛选结果推导出呈现的多肽序列为HWQWPHWSPPP(命名为P11肽).检索相关数据库发现此肽序列未被申请专利,体内约908种蛋白与其结构相匹配,其中包含有与LPS相互作用的位点.结论 通过对噬菌体展示随机肽库的淘选,获得与LPS结合的高亲和性多肽,为进一步以这些多肽为先导物进行定向进化研究提供了实验依据和结构基础.     

HIV辅助受体结合位点配体基因的获得及合成配体体外抑制作用的研究

目的 从构建的噬菌体十肽库中筛选HIV辅助受体的配体，测序后人工合成配体并研究其体外抑制HIVgp120．抗原的活性。方法 采用噬菌体表面表达技术，构建具有一这库容量的噬菌体随机十肽库。以HIVgp120多肽做抗原，经过五轮的亲和筛选获得高亲和力的配体，测序后人工合成配体肽，以ELISA试验检测配体的抑制活性。结果 获得1个与HIV辅助受体结合位点有高亲和力的配体克隆。经核苷酸序列测定，推导出该配体的氨基酸序列并人工合成该配体多肽。结论 筛选得到的展现在噬菌体表面的配体及人工合成的配体，对HIV辅助结合位点均有较好的封闭作用。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.     

脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选

目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14结合位点的多肽序列.方法 以CD14为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定筛选后的噬菌体克隆与CD14的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合CD14的效力.结果 挑取的20个噬菌体克隆中,16个结合实验鉴定阳性,取6个亲和力最高的克隆测序,得到3条不同编码的12肽序列(FHRWPTWPLPSP、MHRHPPPITLPL和AAFHRAHHLTSP),3条多肽与LBP一级结构同源性低,为模拟肽.6个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与CD14结合位点的模拟肽.     

Endoglin特异性结合短肽筛选及功能分析

目的:对噬菌体随机12肽库进行筛选,寻求可与Endoglin结合的小分子短肽并测定其亲和常数.方法:经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定阳性克隆的DNA序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性,非竞争法ELISA固相法计算阳性噬菌体融合肽的亲和常数.结果:三轮生物筛选,噬菌体得到有效富集,竞争性ELISA显示6个阳性噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,测序获得5种多肽序列,优势序列为:AHKHVHHVPVRL,竞争抑制实验显示阳性噬菌体克隆与Endoglin有良好的亲和性,其亲和常数为:(1.431±0.293)×107 mol/L.结论:利用噬菌体肽库技术可以获得亲和力较强的Endoglin的结合肽,为今后进一步研究Endoglin在卵巢癌的早期诊断方面的作用奠定基础.     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的:探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法:以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆(即实验组A450nm值高于对照组3倍以上),并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果:经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高(P<0.05);利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆(C4、C6、C7、C10、C11和C17);通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性(P<0.05);测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论:利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

天花粉蛋白结合肽的筛选及潜在靶点蛋白的同源分析

目的 通过噬菌体展示技术,筛选天花粉蛋白(TCS)的结合多肽,并通过蛋白质同源分析,研究TCS在体内可能直接作用的靶点蛋白。方法 用构建的十五肽库和购买的十二肽库分别对TCS进行4轮固相亲和筛选,并通过噬菌体ELISA检验阳性克隆与靶蛋白的亲和力,对阳性克隆进行测序,并将多肽序列与已登记蛋白序列进行同源性分析。结果 每轮筛选的回收率,及多克隆噬菌体ELISA结果显示筛选有效。通过单克隆噬菌体ELISA结果挑取阳性克隆,测序分析得到若干噬菌体展示多肽序列。经蛋白质同源性分析,TCS特异性结合多肽与蛋白激酶C（PKC）的磷酸化位点具有同源序列。结论 噬菌体展示技术是筛选中药成分靶点蛋白的有效手段,PKC可能为TCS潜在的靶点蛋白。      

甘精胰岛素与胰岛素泵的基础胰岛素剂量比较

目的：甘精胰岛素和胰岛素泵均能为糖尿病（DM）患者提供基础胰岛素，探讨这两种治疗方法之间的剂量关系，总结甘精胰岛素的临床应用经验。方法：DM患者应用胰岛素泵治疗2周，血糖控制理想后，再改为甘精胰岛素及其他降糖药，血糖平稳后，比较甘精胰岛素与胰岛素泵所用胰岛素剂量，分析其相关性。结果：甘精胰岛素剂量约为胰岛素泵总量的35％及基础量的55％，并与之呈直线正相关，相关系数（r）分别为0．77和0．74，差异具有显著性统计学意义（P〈0．001）。结论：甘精胰岛素的起始剂量约为胰岛素泵所用胰岛素总量的35％及基础量的50％，均与甘精胰岛素的起始剂量呈直线正相关。     

外源性胰岛素对于胰岛素一相分泌的影响

目的：探讨外源性胰岛素对离体大鼠胰岛第一时相胰岛素分泌的影响．方法：雄性SD大鼠胰腺采用V型胶原酶经胰管灌注消化分离得到胰岛，用100μU／mL外源性胰岛素分别孵育0，60，120和240min（n=8）后，给予葡萄糖刺激，分别测定0，3，5，10和30min胰岛素分泌量．结果：不同时间胰岛素预处理后，各组在葡萄糖刺激时均产生胰岛素第一时相分泌（P〈0．05），但随着胰岛素孵育时间的延长，胰岛素第一时相分泌峰值降低（P〈0．01）．结论：100μU／mL外源性胰岛素损害胰岛素第一时相分泌，且孵育时间越长，抑制程度越明显．     

外源性胰岛素对于胰岛素一相分泌的影响

目的:探讨外源性胰岛素对离体大鼠胰岛第一时相胰岛素分泌的影响.方法:雄性SD大鼠胰腺采用Ⅴ型胶原酶经胰管灌注消化分离得到胰岛,用100 μU/mL外源性胰岛素分别孵育0,60,120和240 min(n=8)后,给予葡萄糖刺激,分别测定0,3,5,10和30 min胰岛素分泌量.结果:不同时间胰岛素预处理后,各组在葡萄糖刺激时均产生胰岛素第一时相分泌(P＜0.05),但随着胰岛素孵育时间的延长,胰岛素第一时相分泌峰值降低(P＜0.01).结论:100 μU/mL外源性胰岛素损害胰岛素第一时相分泌,且孵育时间越长,抑制程度越明显.     

速效胰岛素类似物与人胰岛素在胰岛素泵中的应用研究

目的:探索速效胰岛素类似物-门冬胰岛素(诺和锐)与人胰岛素(优泌林R)治疗2型糖尿病的疗效特点、安全性.方法:选取2型糖尿病患者60例,随机分成A组和B组,每组30例患者,A组用诺和锐、B组用优泌林R作为泵用胰岛素进行CSⅡ强化治疗.结果:经过治疗,两组空腹血糖、餐后2h血糖均有显著降低,与治疗前比较差异有统计学意义(P＜0.05);A和B组血糖达标时间分别为(4.20土1.86)d和(6.28±1.89)d,门冬胰岛素组达标时间较短(P＜0.05);控制血糖达标时,胰岛素用量显著低于优泌林R组(P＜0.05);诺和锐的用量较优泌林R的用量少,低血糖发生率较优泌林R组低.结论:门冬胰岛素是一种有效的抗糖尿病药物.     

RP-HPLC法测定口服麦胚凝集素修饰脂质体中胰岛素

目的:建立RP-HPLC方法,测定麦胚凝集素修饰脂质体中胰岛素的含量和包封率。方法:利用逆相蒸发-超声法制备麦胚凝集素修饰胰岛素脂质体,反相高效液相色谱法测定脂质体中胰岛素含量和包封率。利用Phenomenex-C_(18)柱(250mm×4.6mm,5μm),乙腈-0.01％三氟乙酸(300:700)为流动相,测定波长为210nm,建立了HPLC测定胰岛素含量的方法。结果:HPLC测定方法线性范围5～100μg/ml,线性关系良好。普通胰岛素脂质体的包封率为(30.30±2.77)％(n=3),麦胚凝集素修饰脂质体包封率为(69.33±4.54〕％(n=3)。结论:建立的RP-HPLC方法便捷准确,重现性好,可用于测定麦胚凝集素修饰脂质体中胰岛素的含量和包封率。     

支气管哮喘患者胰岛素与胰岛素受体的研究

目的 了解支气管哮喘（简称哮喘）患者外周血胰岛素与外周血淋巴细胞胰岛素受体的情况。方法 哮喘患者40例，其中初诊轻中度非激素治疗组（简称未治疗组）20例，轻中度慢性持续期激素治疗组20例（简称治疗组）；健康对照20例。清晨空腹采血，测定外周血白细胞总数和分类计数；测定空腹血糖、胰岛素、胰岛素受体；进行肺功能测定。结果 未治疗组和治疗组哮喘患者外周血中嗜酸粒细胞计数显著高于对照组[（4．04±2．57）％和（4．24±2．34）％比（0．90±1．38）％，P〈0．05]。未治疗组哮喘患者胰岛素、胰岛素受体水平显著高于对照组[胰岛素：（13．00±5．20）mIU／L比（10．08±3．79）mIU／L；胰岛素受体：（2．59±3．11）％比（0．99±0．62）％；P均〈0．05]。结论 哮喘患者在炎症状态下胰岛素分泌增多，胰岛素受体表达增加。     

胰岛素及胰岛素类似物的研究进展

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏或靶组织对胰岛素不敏感而引起的慢性高血糖为特征的代谢性疾病，常引起心脑血管、肾、眼、神经等脏器并发症，严重影响了患者生活质量，据WHO最新数据预测，到2010年全世界将会有2．4亿DM患者。胰岛素（INS）是一多功能的蛋白质激素，除了对糖，脂肪和蛋白质的代谢起着重要的调节作用外，     

速效胰岛素类似物与人胰岛素在2型糖尿病胰岛素泵中应用的比较

目的:人胰岛素作为泵用胰岛素已有较多的经验,而速效胰岛素类似物应用尚不广泛,文中旨在比较这2种剂型在泵输注中的有效性、安全性和应用特点. 方法:共345例2型糖尿病患者,随机以门冬胰岛素和优泌林R作为泵用胰岛素进行CSII强化治疗(门冬胰岛素组173例,优泌林R组172例),监测1d 9次末梢血糖(3餐前后,睡前,0AM和3AM),并观察不同时间段胰岛素用量. 结果:2组患者血糖达标时间分别为(4.40±2.16)d和(5.68±2.29)d,门冬胰岛素组达标时间较短(P<0.05),达标时2组每日胰岛素用量类似;门冬胰岛素组白天段基础率较低,但中餐前大剂量较高;泵治疗后2组各时间点血糖均明显降低,但门冬胰岛素组对空腹和早、晚餐后血糖控制更好,低血糖的发生明显较低(P<0.05). 结论:在CSII强化治疗中,门冬胰岛素可更快、更有效降低血糖,且低血糖风险更低;优泌林R组基础率占日总量的比例较低,主要是白天段基础率.     

皮下胰岛素抵抗的研究进展

皮下胰岛素抵抗是葡萄糖代谢对胰岛素皮下注射不敏感,但对静脉注射敏感,其机制主要是皮肤阻碍或延迟胰岛素吸收进入循环.皮下胰岛素抵抗的治疗包括使用抑肽酶、抗凝剂、肌内注射胰岛素等.文中就皮下胰岛素抵抗的研究进展进行综述.