噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的:探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法:以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆(即实验组A450nm值高于对照组3倍以上),并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果:经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高(P<0.05);利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆(C4、C6、C7、C10、C11和C17);通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性(P<0.05);测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论:利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的：探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法：以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆（即实验组A450nm值高于对照组3倍以上）,并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果：经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高（P<0.05）;利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆（C4、C6、C7、C10、C11和C17）;通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性（P<0.05）;测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论：利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

从噬菌体随机肽库中筛选及鉴定肺癌特异性多肽

目的 利用Phage display随机肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,并通过ELISA和免疫组化鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础.方法 以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肤库进行四轮减性筛选,挑取单克隆、扩增纯化噬菌体、并经ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;对阳性克隆提取质粒,浏序后合成多肤,多肽标记荧光素FITC,以其在肺癌组织芯片上鉴定多肽的亲和力及特异性.结果 经ELISA初步鏊定,随机挑选的18个单克隆中,其中3号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为Phage ZL-3.细胞免疫荧光试验进一步证明,荧光素标记的多肽FITC-ZL-3对NCI-H1299具有高亲和力.结论 利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZL-3,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础.     

从噬菌体随机肽库中筛选及鉴定肺癌特异性的多肽*

目的 利用Phage display随机肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,并通过Elisa和免疫组化鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法 以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行四轮减性筛选,挑取单克隆、扩增纯化噬菌体、并经ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;对阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,多肽标记荧光素FITC,以其在肺癌组织芯片上鉴定多肽的亲和力及特异性。结果 经ELISA初步鉴定,随机挑选的18个单克隆中,其中3号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为Phage ZL-3。细胞免疫荧光试验进一步证明,荧光素标记的多肽FITC-ZL-3对NCI-H1299具有高亲和力。结论 利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZL-3,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

基于肺癌细胞特异性结合肽检测肺癌的免疫酶法

以肺腺癌A549细胞为筛选靶标,人胚肺二倍体helf细胞作反相吸附细胞,从噬菌体随机十二肽库中筛选出与肺癌细胞特异性结合的噬菌体多肽,用其替代一抗,酶标抗噬菌体抗体作二抗,建立检测肺癌细胞的免疫酶染色法。对噬菌体随机十二肽库进行4轮筛选和ELISA鉴定后,用亲和力和特异性最好的5号噬菌体克隆建立了检测肺癌细胞的免疫酶法。     

应用噬菌体展示技术筛选缺氧诱导因子-1α相关肽

目的：应用噬菌体展示12肽库筛选低氧诱导因子—α(HIF—α)相关肽。方法：以抗HIF—α单克隆抗体(HIF—αmAb)为配基，采用亲和免疫法从随机12肽库中筛选与抗体特异结合的噬菌体。在筛选过程中，逐轮提高HIF—αmAb的稀释度并增强洗脱强度。3轮筛选后，随机挑取10个克隆测序。通过膜斑点印迹(Dot-ELISA)进行特异性结合鉴定。结果：经过3轮筛选后，特异性结合的噬菌体得到有效的富集，并且Dot-ELISA反应阳性逐轮增强。测序后发现有4个克隆的序列完全相同，其12肽氨基酸序列为GPHHYWYHLRLP。结论：噬菌体展示肽库技术可以用于筛选HIF—1相关肽，并为后续的活性鉴定打下基础。     

Screening of TACE Peptide Inhibitors from Phage Display Peptide Library

Summary： To obtain the recombinant tumor necrosis factor-α converting enzyme （TACE） ectodomain and use it as a selective molecule for the screening of TACE peptide inhibitors, the cDNA coding catalytic domain （TS00） and full-length ectodomain （T1300） of TACE were amplified by RT-PCR, and the expres.sion plasmids were constructed by inserting T800 and T1300 into plasmid pET-28a and pET-28c respectively. The recombinant TS00 and T1300 were induced by IPTG, and SDS-PAGE and Western blotting analysis results revealed that TS00 and T1300 were highly expressed in the form of inclusion body. After Ni^2＋-NTA resin affinity chromatography, the recombinant proreins were used in the screening of TACE-binding peptides from phage display peptide library respectively. After 4 rounds of biopanning, the positive phage clones were analyzed by ELISA, competitive inhibition assay and DNA sequencing. A common amino acid sequence （TRWLVYFSRPYLVAT） was found and synthesized. The synthetic peptide could inhibit the TNF-α release from LPS-stimulated human peripheral blood mononuclear cells （PBMC） up to 60.3%. FACS analysis revealed that the peptide mediated the accumulation of TNF-α on the cell surface. These results demonstrate that the TACE binding peptide is an effective antagonist of TACE.     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF 7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。     

利钾尿肽与心钠素在急性脑血管疾病中的作用

目的：探讨利钾尿肽（KP）与心钠素摩尔比在急性脑血管疾病（ACVD）中的意义。方法：用放射免疫分析方法测定34例ACVD患者发病没时期血浆KP和心钠素（ANP）含量。结果：急性脑血管疾病患者在发病第7天血管KP水平升高、病程中ANP含量明显升高（P＜0．05），病程第1天、第3天KP与ANP摩尔比显著低于对照组（P＜0．05）。结论：KP、ANP含量及KP与ANP比例关系的改变在脑血管疾病病理生理中起着一定的作用。     

乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶消化肽图的LC-MS验证

目的：验证乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶消化反相高效液相色谱（RP－HPLC）特征肽图的可信度。方法：采用液质联用的方法对胰蛋白消化后的多肽片断进行质量解析。结果：乙肝治疗性疏水肽的胰蛋白酶切片段与理论上计算值相符。结论：通过直接采用疏水肽悬液制作乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶RP－HPLC肽图的方法切实可行。     

从噬菌体随机十二肽库中筛选乙酰胆碱酯酶的抑制肽

目的从随机肽库中筛选乙酰胆碱酯酶（ACHE）的抑制性多肽。方法以人AChE作为靶标，应用噬菌体随机12肽库进行筛选，经过3轮筛选，对阳性克隆进行测序并进行序列分析及抑酶活性测定。结果筛选得到6个能与人AChE较强结合的噬菌体克隆，其中有4个克隆可以抑制AChE的酶活性，其保守序列为W（S／P）HY。结论通过噬菌体肽库技术能够筛选到抑制人AChE活性的多肽，为进一步研究AChE的多肽抑制剂奠定了基础。     

以小鼠精子/睾丸特异性抗原为基础的合成肽免疫避孕效应研究

目的：研制以精子/睾丸特异性抗原为基础的多价嵌合肽避孕疫苗。方法：选择小鼠精子/睾丸特异性抗原Sp17、Gy-ritestin作为对象，采用分子设计的方法与外源性牛核糖核酸酶非选择性T细胞表位组合合成新型嵌合肽-35肽，并对其免疫效应进行研究。结果：该嵌合肽可刺激小鼠产生较高效价的血清和阴道粘膜特异性抗体，诱导脾脏淋巴细胞增殖，促进细胞因子IL-4的分泌；将其与佛氏佐剂混悬，免疫雌性BALB/c小鼠可明显降低受孕率和每胎产仔率，其抗血清可显著抑制体外精-卵结合和融合。结论：新型嵌合肽具有较明确的抗生育作用，提示以分子设计、蛋白质优化方案进行多价避孕疫苗的研究是可行的。     

哑铃型树枝状多肽大分子的合成

目的：合成哑铃型树枝状多肽大分子。方法通过引入小分子化合物Fmoc-Gly-OH作为连接臂,高产率得到双端氨基化聚乙二醇（NH2-CH2-COO-PEG2000-OOC-CH2-NH2）;然后再分别以双芴甲氧羰基保护的赖氨酸〔Fmoc-Lys（Fmoc）-OH〕、芴甲氧羰基及叔丁氧羰基保护的赖氨酸〔Fmoc-Lys（Boc）-OH〕为支化单元,采用液相发散法合成了表面富含氨基的哑铃型PEG/赖氨酸树枝状大分子共聚物。结果和结论利用1H NMR和MS对中间产物及终产物的结构和相对分子质量进行表征,结果表明成功合成了哑铃型树状多肽大分子,为其在生物医学领域的应用打下基础。