携带BMP-2基因的慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞定向分化

目的构建含有人骨形态发生蛋白2（human bone morphogenetic protein 2, hBMP2）cDNA的重组慢病毒DNA，在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测。用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后，观察其向成骨细胞分化的情况。方法从GenBank中调出hBMP2基因序列，设计带有NheⅠ、AgeⅠ酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA，再反转录成cDNA，扩增出hBMP2 cDNA的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上，通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒DNA。将该重组慢病毒DNA同辅助质粒一起共感染293T细胞，通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞，通过碱性磷酸酶（AP）、钙沉积定量测定、Ⅰ型胶原蛋白表达观察干细胞向成骨细胞转化的情况。结果①扩增出1．2kb左右的hBMP2全长cDNA与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致；②成功构建和克隆了含hBMP2基因的慢病毒重组DNA（pHIV-hBMP2）；③对重组慢病毒DNA进行了成功包装和分析。④大鼠骨髓间质干细胞感染慢病毒后，碱性磷酸酶分泌增加，钙沉积增加，Ⅰ型胶原蛋白表达增加，成功向成骨细胞转化。结论重组慢病毒携带hBMP2基因感染大鼠骨髓间质干细胞可以使其向成骨细胞定向分化，为组织工程研究提供良好的种子细胞。     

胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

重组慢病毒载体pLKO-1-EGFP-puro的构建

目的：构建具有绿色荧光蛋白（GFP）标记及嘌呤霉素（puro）抗性的重组慢病毒载体。方法：改建慢病毒载体质粒pLKO-1-puro的多克隆位点（MCS）,以质粒pEGFP-C3为模板扩增出CMV-EGFP并与pLKO-1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro,后者与包装质粒Δ8.2和包膜蛋白质粒VSV-G在293T细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒,感染非洲绿猴肾细胞Vero细胞,观察GFP的表达。结果：成功改建了慢病毒载体质粒pLKO-1-puro并插入了CMV-EGFP,形成了新型慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro。3质粒共转染293T细胞产生的重组慢病毒颗粒感染Vero细胞后高表达绿色荧光。结论：成功构建了高效的带GFP报告基因及嘌呤霉素抗性的慢病毒载体。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建人谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法：从质粒中通过PCR的方法扩增出目的基因GST-π并带有适宜的酶切位点,双酶切后连pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-GST-π,经酶切线性化后,采用电穿孔转化到含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中,挑选同源重组质粒AdEasy-GST-π,酶切线性化重组质粒并转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清乒乓交互感染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果：经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论：成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体,为利用GST-π基因转染造血干细胞的基因治疗奠定了基础。     

人K562细胞糖皮质激素受体基因阻断模型的建立

目的 利用腺病毒载体介导的RNAi技术，建立糖皮质激素受体基因阻断的人K562细胞模型。方法 将针对糖皮质激素受体发挥RNAi效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中，在含有pAdEasy-I病毒骨架的BJ5183大肠菌内进行同源重组；重组体通过脂质体介导转染293T细胞，并在293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒，通过反复感染扩增病毒以达感染靶细胞的适当滴度，通过绿色荧光表达来监测腺病毒扩增；应用Western blot法检测人K562细胞感染病毒后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果 重组腺病毒穿梭质粒psiGR/Adeno和重组腺病毒pAdEasy-siGR的成功构建；转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光，随着时间逐渐增强并且出现明显的细胞病变效应，经过3轮扩增，病毒达到合适的滴度；受腺病毒感染的K562细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论 可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNAi腺病毒载体，为进一步研究糖皮质激素受体的生物学功能奠定基础。     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

重组慢病毒载体介导HIV-1 Nef蛋白对原发性渗出性淋巴瘤细胞系和血管内皮细胞增殖作用影响的初探

目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含Nef基因的重组真核表达质粒pCI-neo-Nef中扩增出Nef基因,插入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green中构建成pHAGE-Nef,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达并收集培养上清,此上清经0.45μm滤器过滤后即获得慢病毒悬液。梯度稀释法测定慢病毒滴度。将重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,用Western blot检测Nef蛋白的表达。通过细胞增殖实验检测Nef蛋白对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建了含HIV-1 Nef基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为1×107 TU/ml。以重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.h...     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究

目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs)。方法运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,MluⅠ、EcoRⅠ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为0.1×109~1×109TU/mL。pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。     

重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶（IDO）基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况;采用Wester blot 检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。     

SOX9基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建SOX9基因的慢病毒载体并使其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中表达.方法 通过RT-PCR获得人SOX9基因编码区(CDS)片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产生Pwpxl-MOD2/SOX9,将Pwpxl-MOD2/SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染293T细胞,获得携带目的基因SOX9基因的重组病毒.同时共转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照.包装好的慢病毒体外感染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫印迹检测SOX9的表达;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插入片段为基因SOX9.病毒感染MSCs后,经RT-PCR法和免疫印迹证实SOX9基因在MSCs中表达.MTT法检测示慢病毒感染对骨髓间克质干细胞的生长未产生显著影响.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞后能够稳定表达SOX9.为研究椎间盘退变的基因及生物学治疗提供了实验依据.     

Construction of hepatocyte growth factor gene recombinant adenovirus vector and its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells

ObjectiveTo construct the adenoviral expression vector system containing human hepatocyte growth factor (hHGF) cDNA, and to further study the transduction efficiency and the expression of HGF in mesenchymal stem cells (MSCs). MethodsThe HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMV-HGF, and was subcloned into the adenovirus shuttle plasmid pDC316-IRES-EGFP vector containing a green fluorescence protein (GFP) reporter gene. Virus Ad-HGF was produced by homologous recombination in HEK293 package cells. Bone marrow derived MSCs were harvested and cultured, and then were transduced with Ad-HGF. The efficiency of Ad-HGF transduction was assessed by FACS analysis using GFP gene expression. And HGF/MSCs were generated. The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA using anti-human HGF monoclonal antibody. Results The recombinant, named pDC316-HGF-IRES-eGFP, was digested with restriction enzyme, and the DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genebank and did not reveal any mutation. GFP expression could be observed on the second day after packing of the linearized pAd-HGF in HEK293 cells and 7.15×1010pfu/ml titer of Ad-HGF was obtained. Forty-eight hours after transduction, 96.89% of HGF/MSCs were GFP positive. Peak concentration levels of hHGF(103ng/mL) in the cultured supernatants were detected on day 2 post-transduction, and the adenovirus-mediated expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo. ConclusionOur data demonstrated that the adenovirus expression'vector system pDC316-HGF-IRES-EGFP has been constructed successfully, and their effective expressions also have been obtained in MSCs. This will provide material basis for the next study on liver regeneration after small-for-size liver transplantation.     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

麦胚凝集素慢病毒载体的构建及其对脂肪干细胞的感染

目的探讨麦胚凝集素（WGA）慢病毒载体的构建与表达的方法,以及WGA在神经系统中跨膜示踪的能力。方法 采用基因工程方法,将WGA的基因插入到慢病毒表达载体Plvx-IRES-ZsGreen1 中。再采用慢病毒包装,将构建好的质粒 和其他3 种包装质粒（RPEV、PRRE、VSVG）在293T细胞中进行共转染,获取病毒液后感染人源的脂肪干细胞（hADSCs）, 将感染后的hADSCs 注入小鼠的脑卒中模型,修复神经损伤。结果显微镜下检测到绿色荧光报告蛋白表示感染成功。 对感染后的hADSCs 进行免疫组化显色,结果显示WGA已经成功的在hADSCs 中实现了表达,在MCAO小鼠模型脑损伤 处追踪到感染了WGA的hADSCs。结论慢病毒包装WGA蛋白的方法可靠高效,可以作为一种高效的示踪技术广泛应 用于各类细胞。     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。     

CO-TRANSFECTION OF RAT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS WITH HUMAN BMP2 AND VEGF165 GENES

Objective To explore the feasibility and efficacy of lentivirus-mediated co-transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene. Methods The hVEGF165 and hBMP2 cDNAs were obtained from human osteosarcoma cell line MG63 and cloned into lentiviral expression vectors designed to co-express the copepod green fluorescent protein (copGFP). The expression lentivector and packaging Plasmid Mix were co-transferred to 293TN cells, which produced the lentivirus carrying hVEGF165 (Lv-VEGF) or hBMP2 (Lv-BMP), respectively. MSCs of Wistar rats were co-transfected with Lv-BMP and Lv-VEGF (BMP+VEGF group), or each alone (BMP group and VEGF group), or with no virus (Control group). The mRNA and protein expressions of hVEGF165 and hBMP2 genes in each group were detected by real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral expression vectors carrying hVEGF165 or hBMP2 were correctly constructed and confirmed by restriction endonucleses analysis and DNA sequencing analysis. A transfer efficiency up to 90% was archieved in all the transfected groups detected by the fraction of fluorescent cells using fluorescent microscopy. From the results generated by real-time PCR and ELISA, VEGF165 and BMP2 genes were co-expressed in BMP+VEGF group. No significant difference of BMP2 expression was detected between BMP+VEGF and BMP groups (P>0.05). Similarly, there was no significant difference of VEGF165 expression between BMP+VEGF and VEGF groups (P>0.05). Conclusion VEGF165 and BMP2 genes were successfully co-expressed in MSCs by lentivirus-mediated co-transfection, which provided a further foundation for the combined gene therapy of bone regeneration.     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。