慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究

目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.     

LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备

目的: 制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒. 方法: 采用RT- PCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGW中. 经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体. 在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-LMP1导入病毒包装细胞293FT, 荧光显微镜检测基因的表达,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩,PCR鉴定. 结果: 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合; LMP1准确克隆入FUGW的多克隆位点. 慢病毒的3种质粒可高效转染入293FT细胞,荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光. 绿色荧光位于细胞的胞膜及胞质. 结论: 成功制备了LMP1与GFP融合基因慢病毒,为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs).方法 运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,Mlu Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切反应及测序分析加以鉴定.将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度.将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测.结果 构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致.三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度为0.1×109～1×109TU/mL.pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞.结论 成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性.     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

人BDNF和GFP基因共表达慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的构建人脑源性神经营养因子(hBDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体并转染神经干细胞(NSCs)。方法运用基因重组技术,将hBDNF基因连接到带GFP的慢病毒表达载体pWPXL-MOD(pWPXL-GFP-IRES-GFP)中,构建慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-GFP,MluⅠ、EcoRⅠ双酶切反应及测序分析加以鉴定。将慢病毒载体主体质粒pWPXL-hBDNF-IRES-GFP、包装质粒HELPER和包膜质粒VSVG共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。将构建的pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染NSCs,并对感染细胞进行鉴定及分化活性检测。结果构建的慢病毒载体pWPXL-hBDNF-IRES-EGFP经MluⅠ和EcoRⅠ双酶切反应鉴定正确;测序分析证实与Genbank报道的hBDNF基因序列完全一致。三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为0.1×109~1×109TU/mL。pWPXL-hBDNF-IRES-GFP感染后的NSCs表达绿色荧光,可在体外扩增,NSCs细胞标志物巢蛋白表达阳性;细胞贴壁后可分化为神经元和胶质细胞。结论成功构建hBDNF与GFP基因共表达的慢病毒载体并转染NSCs,转染后细胞仍能保持已知的原有生物学特性及良好的分化活性。     

Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。     

mCD99L2基因干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建mCD99L2(mouse CD99 antigen-like 2)基因RNA干扰慢病毒表达载体,检测其对293FT细胞的感染效率.方法 应用基因工程技术,首先设计并合成4对siRNA序列,退火、酶切并连接于慢病毒表达载体SD1259,构建携带针对目的 基因mCD99L2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体(其中包括1条阴性对照序列);然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293FT细胞,转染48 h后收集上清离心过滤,浓缩病毒,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果 构建3个携带针对目的 基因mCD99L2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293FT细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×107/ml,适合感染目的 细胞.结论 应用基因工程技术成功构建了mCD99L2基因RNA干扰慢病毒表达载体,为进一步构建类人霍奇金淋巴瘤可视化细胞模型及动物模型奠定了基础.     

人FGF-9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建人成纤维细胞生长因子-9（FGF-9）慢病毒表达载体,鉴定其表达,并对慢病毒载体进行包装,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。方法PCR扩增人FGF-9基因。全长序列交换入线性表达载体,连接产物转化感受态细胞,PCR及基因测序鉴定阳性克隆。重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达,Western—blot鉴定FGF-9表达。重组病毒质粒在脂质体介导下与结构质粒和包膜质粒共转染293T细胞包装成人FGF-9过表达慢病毒,RT—qPCR测定滴度。结果PCR及测序证实人FGF-9基因正确克隆至病毒质粒;感染293T细胞后,荧光显微镜观察到eGFP,Western—blot检测到FGF一9融合蛋白表达;三质粒共转染293T细胞获得慢病毒,测其浓度为2×10^8TU／mL。结论成功构建人FGF-9慢病毒表达载体．可在293T细胞中表达,并包装成慢病毒,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默

目的：构建p66shc基因重组慢病毒表达载体,并将之转染至293T细胞,通过RNA干扰致使p66shc基因沉默,为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点,命名为p66shc‐shc1、p66shc‐shc2、p66shc‐shc3,与双酶切后的pLenR‐绿色荧光蛋白（GPH）（含有GFP表达）连接,转化入感受态的DH5α细胞,挑取阳性克隆测序正确后,与pRsv‐REV、pM‐Dlg‐pRRE、pMD2G一起转染293T细胞,于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达,证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Westernblot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达,选取有效沉默p66shc基因的p66shc‐shc1靶点,为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内,通过荧光定量PCR及Westernblot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体,转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。     

S100A11慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建S100A11基因慢病毒表达载体,建立Huh-7 S100A11稳定细胞株,并鉴定其表达. 方法 RT-PCR扩增S100A11基因片段,与pWPT载体经Mlu Ⅰ和Not Ⅰ同时酶切后连接,构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11;将表达载体pWPT-GFP和pWPT-S100A11与慢病毒包装质粒pMD2.G和psPAX2共同感染293T细胞,获得携带GFP和S100A11基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞,获得Huh-7 S100A11和Huh-7GFP稳定细胞株;利用Real-Time PCR和Western Blotting实验方法检测感染后S100A11的过表达情况. 结果 成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11;慢病毒感染Huh-7细胞株后,阳性对照Huh-7GFP经荧光镜检测传染率达95％;感染Huh-7细胞后S100A11的mRNA和蛋白表达量均增加. 结论 成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11,并建立了Huh-7S100A11稳定细胞株,为进一步研究S100A11基因在肝癌中的生物学功能和机制奠定了基础.     

Construction of GFP-AWP1 fusion gene vector and its expression in 293 cells]

OBJECTIVE: To construct green fluorescent protein (GFP)-AWP1 (a novel human protein associated with protein kinase C-related kinase 1) fusion gene vector for observing the expression and localization of AWP1 in 293 cells. METHODS: The coding region in AWP1 cDNA was amplified by RT-PCR from human endothelial cell line ECV304 and recombined into pEGFP-C2 plasmid expressing GFP. After identification with restriction endonucleases and sequence analysis, the recombinant plasmid was transfected into 293 cells with the cationic liposome DOTAP as the transfection reagent. The expression and localization of AWP1 were observed under a fluorescence microscope. RESULTS: Restriction endonuclease assay and sequence analysis verified the successful construction of the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1, and GFP-AWP1 fusion protein was highly efficiently expressed in 293 cells. Under fluorescent microscope, green fluorescence was seen homogeneously distributed in the entire cell body of the cells transfected by the empty vector pEGFP-C2, but diffusely in the cytoplasm of the cells transfected by the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1. CONCLUSION: GFP-AWP1 fusion gene vector is successfully constructed and the fusion protein expressed in the cytoplasm of 293 cells.     

应用RNAi敲减MARCH6基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及#br# 周期的影响

目的：应用慢病毒介导的RNAi技术,在乳腺癌MCF-7细胞中敲减MARCH6基因的表达,研究其对MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响。方法：靶向MARCH6基因的shRNA慢病毒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察转染效率;收集慢病毒液感染MCF-7细胞后,应用实时荧光PCR和Western印迹验证RNAi敲减MARCH6基因后,MARCH6基因mRNA和蛋白的表达影响;应用MTT,BrdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力的变化;采用增殖指数染色流式细胞术检测细胞周期和增殖的改变。结果：通过在荧光显微镜下观察,MARCH6 shRNA慢病毒质粒成功转染293T细胞,与同明视野对比,可见80%左右的细胞带绿色荧光;感染MCF-7细胞,90%的细胞均带绿色荧光; 实时荧光PCR和Western印迹验证了MARCH6 shRNA慢病毒感染MCF-7细胞后,MARCH6在转录水平和蛋白水平表达均显著下降;MTT实验、BrdU法结果显示MARCH6基因敲减组的MCF-7细胞增殖显著下降(P<0.01),流式细胞术分析显示MARCH6敲减后MCF-7细胞出现细胞周期抑制,细胞分裂处于G1期细胞数明显增多,增殖指数显著降低。结论：敲减乳腺癌MCF-7细胞的MARCH6基因表达后,抑制了MCF-7细胞的增殖,并引起细胞周期G1期阻滞。提示MARCH6通过影响细胞周期的进展,促进乳腺癌细胞的增殖。     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

NOD小鼠CD8α+抗原基因克隆载体的构建及其相关蛋白在树突状细胞中的表达

目的：构建NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组慢病毒载体,探讨其在树突状细胞（DCs）中的表达,阐明1型糖尿病（T1DM）的发病机理。方法：设计CD8α+基因特异性引物,从NOD小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增CD8α⁺基因,与质粒载体pCDF1-MCS2-EF1-COPGFP进行连接重组,经过转化、筛选、鉴定和序列测定后,应用Western blotting法检测CD8α⁺基因的表达。应用Nanofectin脂质体转染试剂将含有目的基因的质粒转染HEK293细胞,进行重组慢病毒载体包装,将包装后的重组慢病毒颗粒感染DCs,采用Western blotting法检测CD8α⁺蛋白的表达。结果：成功构建了NOD小鼠CD8α⁺抗原基因的重组质粒载体,重组表达载体经转染HEK293细胞获得了重组病毒的原液,重组病毒扩增后感染DCs,免疫荧光下可见DCs内含有绿色荧光蛋白(GFP)表达。结论：NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组病毒载体构建成功,且有相关蛋白表达。
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携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素(PTHLH)基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒(含EGFP基因)上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒(pGC-FU)和过表达PTHLH的慢病毒(pGC-FU/PTHLH);或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN4的构建及HCN4重组慢病毒的包装

目的将全长约3．6kb的HCN4目的基因片段从pCDNA3-HCN4质粒卸载下来,建立稳定的HCN4重组慢病毒。方法用EcoRI和XbaI从pCDNA3-HCN4质粒切下HCN4目的片段连接到Pucl9载体中,再用EcoRI和饿蒯Ⅲ从质粒Pucl9切下目的片段并连接到pcDNA3．1（A）载体中,再用XbaI单酶从质粒pcDNA3．1（A）双切到pCDHl-MCSl-EFl-copGFP中。用XbaI或者EcoRI鉴定,将阳性克隆质粒送上海生工测序,慢病毒的包装参照SBI的LentivectorExpressionSystem操作手册进行。将构建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞。结果（1）XbaI及EcoRI鉴定表明,PCR产物和克隆扩增产物的电泳结果显示该基因的大小约为3．6kb;阳性克隆质粒测序结果与GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同;构建的目的基因质粒转染293细胞和原代猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光出现。（2）构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞后,发现有强烈的绿色荧光出现,细胞感染率达90％以上。结论（1）成功将全长HCN4目的基因片段从pCDNA3-HCN4质粒卸载下来,成功构建穿梭质粒pCDHl-MCSl-EFl-copGFP。（2）成功建立稳定的HCN4重组慢病毒,该病毒载体有很高的转染效率。