吲哚-3-甲醇对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响

目的 探讨吲哚-3-甲醇(13C)对人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖和凋亡的影响.方法 不同浓度的I3C(100、150、200、250、300、350 μmol/L)处理细胞48 h后,显微镜下观察细胞生长状况;采用WST-1法检测细胞增殖情况,Hoehest33258染色、TUNEL染色检测细胞凋亡情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白.结果 I3C能够抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导细胞凋亡,处理浓度在250 μmol/L以下时,细胞生长变慢;处理浓度达到300μmol/L时,大量细胞凋亡.I3C浓度高于200 μmol/L时CytC、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3蛋白表达明显增加,且随着I3C浓度的增加三种蛋白的表达也明显增加.结论 I3C在体外实验条件下可抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖并诱导其发生凋亡.     

索拉非尼联合5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肝癌SMMC-7721细胞DNMT3B基因表达的影响

目的:探讨索拉非尼联合5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞SMMC-7721的作用及其调控DNMT3B基因表达可能的分子 机制.方法:单独及联合给药后以MTT法测定SMMC-7721的增殖,Transwell检测其侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法观 察DNMT3B、p-Akt-Ser473及ERK蛋白的表达.结果:索拉非尼、5-Aza-CdR对肝癌SMMC-7721细胞半数抑制浓度(IC50)分别为11、6 μmol/L,联合用药选取(6+4)μmol/L作为后续用药浓 度.与对照组比较单药及联合用药均能抑制细胞侵袭、促进细胞凋亡、减少p-Akt-Ser473和DNMT3B蛋白的表达(P<0.05~P<0.01).结论:索拉非尼和5-Aza-CdR联合用药能有效降低索拉非尼用药浓度,降低肝癌SMMC-7721细胞DNMT3B蛋白表达水平.     

GTPBP4对肝细胞癌生物学行为影响及其机制的研究

目的 探讨肝癌细胞株SMMC-7721中GTD连接蛋白(GTPBP)4基因的表达下调对细胞体内外生物学行为的影响及其作用机制.方法 采用免疫组织化学方法比较肝癌组织和癌旁组织GTPBP4的表达水平差异.运用实时荧光定量PCR技术检测4种人肝癌细胞株(SMMC-7721、HEPG2、HUH-7、HEP3B)中GTPBP4 mRNA的表达.利用RNA干扰技术下调肝癌细胞株SMMC-7721中GTPBP4的表达水平,并观察细胞的生物学行为变化.结果 在肝癌组织芯片中,GTPBP4蛋白在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织.GTPBP4在4种肝癌细胞株中均明显上调.下调GTPBP4的表达后,肝癌细胞增殖能力减弱;细胞凋亡增多;处于S期、G1期的细胞无明显变化,处于G2期的细胞增多;细胞体外克隆形成能力减弱;裸鼠体内成瘤能力减弱.表达谱基因芯片结果显示GTPBP4敲减后SMMC-7721细胞内基因发生改变的有333个,其中上调的有134个,下调的有199个.通路富集分析找到富集的差异基因所在的10条信号通路.Western blot显示GTPBP4表达下调后与细胞周期调控相关的基因CCND1、CCND2、CDK6、MDM2的表达水平发生明显变化.结论 GTPBP4作为一促肝癌基因,其可能通过调控细胞周期关键基因的表达从而影响肝细胞癌的生物学行为.     

塞来昔布通过ERK1/2信号通路对肝癌细胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影响

目的:观察COX-2抑制剂塞来昔布对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖抑制和凋亡诱导作用,并探讨该作用与ERK1/2信号通路之间的关系。方法:用不同浓度的塞来昔布溶液(0、25、50、75和100μmol/L)处理对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞,MTT比色法检测不同时间点各药物浓度组细胞增殖情况;流式细胞术分析不同浓度的塞来昔布溶液对SMMC-7721细胞凋亡的影响;RT-PCR检测COX-2、VEGF和ERK1/2mRNA表达的变化;Western blot检测COX-2、VEGF和ERK1/2蛋白表达的变化。结果:塞来昔布对SMMC-7721细胞增殖具有抑制作用,该作用随着药物浓度的增加和作用时间的延长而增强;流式细胞术检测结果显示出明显的细胞凋亡,且凋亡率随着塞来昔布浓度的增高而升高;随着塞来昔布剂量的增加,COX-2、VEGF和ERK1/2mRNA及蛋白的表达水平逐渐降低。结论:塞来昔布可抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖、促使瘤细胞凋亡,且作用呈时间和剂量依赖性,其机制可能与下调ERK1/2信号通路及抑制新生血管生成有关。     

白藜芦醇对人肝癌细胞SMMC-7721增殖影响的研究

目的已有较多研究表明白藜芦醇能抑制多种肿瘤的生长和促进肿瘤细胞的凋亡,观察白藜芦醇对原发性肝癌(简称肝癌)细胞SMMC-7721增殖的影响,探讨其可能的调控机制。方法 MTT法观察不同浓度白藜芦醇(50、100μmol/L)对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响;应用锥虫蓝拒染法检测白藜芦醇对肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒性作用;流式细胞术测定肝癌细胞SMMC-7721细胞周期的变化;Western blot法测定细胞周期相关蛋白(Cyclin D1、Cyclin E、P21)变化。结果白藜芦醇呈浓度和时间依赖地抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖(P<0.05)。100μmol/L白藜芦醇干预48 h后,可使G0/G1期肝癌SMMC-7721细胞比例升高,S期细胞比例下降,Cyclin D1和Cyclin E的蛋白表达水平均受到抑制,同时P21蛋白的表达水平上调(P<0.05)。结论白藜芦醇可能通过调控细胞周期来抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖。     

miR-122调控LAMC1表达与肝癌细胞迁移侵袭相关性研究

目的探讨mi R-122调控LAMC1表达与肝癌细胞迁移侵袭相关性研究。方法选取人正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株Hep G2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721,构建mi R-122 mimics稳定表达载体并对其进行转染,Real-Time PCR检测各组细胞株内micro RNA-122含量;CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡;划痕实验检测肝癌细胞迁移侵袭能力;生物信息学预测、荧光报告载体实验Real-Time PCR检测层粘连蛋白γ1(Recombinant laminin gamma 1,LAMC1)m RNA水平变化。结果与对照组人正常肝细胞株LO2相比,mi R-122过表达后,肝癌细胞株Hep G2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著升高,LAMC1 m RNA含量显著降低,肝癌细胞株Hep G2和高转移能力肝癌细胞株SMMC-7721细胞侵袭和迁移能力显著下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论上调mi R-122表达可通过调控LAMC1表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

抗坏血酸与三氧化二砷联合应用诱导肝癌细胞凋亡

目的探讨抗坏血酸(ascorbic acid,AA)与三氧化二砷(As2O3)联合应用增强肝癌细胞凋亡的作用。方法肝癌细胞株BEL-7402及SMMC-7721细胞分别用As2O3(1 μmol/L)、AA(62.5 μmol/L)、As2O3(1 μmol/L) AA(62.5 μmol/L)处理24～96 h,流式细胞仪上检测细胞凋亡百分率;用试剂盒法测定细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量。结果1 μmol/As2O3作用24～96 h有诱导BEL-7400及SMMC-7721细胞凋亡的作用,从(62.5 μmol/L) As2O3(1 μmol/L)作用72 h BEL-7402细胞凋亡百分率为(61.7±0.8)%,SMMC-7721细胞为(26.8±0.9)%,较单独应用As2O3(1 μmol/L)的凋亡百分率[(40.2±0.8)%;(11.4±0.5)%]明显增高。As2O3(1 μmol/L)单独作用对SMMC-7721和BEL-7402细胞内GSH的含量无明显影响。从(62.5 μmol/L)单独作用对BEL-7402细胞内GSH的含量无明显影响,但可明显降低SMMC-7721细胞内GSH的含量(P<0.05)。AA(62.5 μmol/L)与As2O3(1 μmol/L)联合作用可明显降低SMMC-7721和BEL-7402细胞内GSH的含量(P<0.05),SMMC-7721细胞内GSH的含量降低更显著(P<0.01)。结论AA及As2O3联合应用能增强肝癌细胞株BEL-7402及SMMC- 7721细胞凋亡作用,尤其是对As2O3不敏感细胞株SMMC-7721细胞作用更显著。     

甘草黄酮诱导肝癌ＳＭＭＣ-７７２１细胞凋亡及其对相关蛋白ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的影响

目的:探讨甘草黄酮(GF9)对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用及其机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测GF9对人肝癌细胞SMMC-7721细胞生长的影响,Hoechst染色法和电镜观察GF9诱导细胞凋亡的形态变化,流式细胞仪检测GF9诱导的细胞凋亡率,并通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白survivin和pro-caspase-3表达水平的变化.结果:GF9可抑制SMMC-7721细胞增殖,并呈时间剂量效应;400 μmol/L GF9可诱导细胞凋亡,呈时间依赖性;随着GF9作用时间的延长,survivin和pro-caspase-3表达下调.结论:GF9能诱导SMMC-7721细胞凋亡,这可能与GF9能够引起抑制凋亡蛋白survivin的下调有关.     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( ),将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,经G418筛选,建立稳定表达的细胞株,用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达,同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。     

人血管内皮生长因子shRNA真核表达载体对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,观察对其增殖影响。方法:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及细胞的克隆形成能力的变化。结果:VEGF shRNA真核表达载体大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,转染后细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;MTT法观察细胞生长速度变慢,单个细胞的克隆形成能力明显下降。结论:VEGF shRNA真核表达载体可明显抑制SMMC-7721细胞增殖能力,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

紫草素通过抑制PKM2/PHD3/HIF-1α通路诱导肝癌细胞凋亡

目的 探讨紫草素诱导人肝癌细胞SMMC-7721死亡的可能机制。方法 体外培养人肝癌细胞（SMMC-7721）和正常肝细胞（L-02）,实验分为对照组和紫草素给药组（4、8、16μmol/L）。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,MTT法检测细胞活力,试剂盒检测三磷酸腺苷（ATP）和乳酸水平,免疫共沉淀和免疫荧光双染实验明确M2型丙酮酸激酶（PKM2）、脯氨酰酸羟化酶3(PHD3)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)三者之间的作用关系及蛋白表达情况;Annexin V/PI检测细胞凋亡;Western blot观察PKM2、PHD3、HIF-1α及凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2表达水平;采用小干扰核糖核酸（siRNA）干扰法建立PKM2低表达的人肝癌SMMC-7721细胞,Western blot检测PKM2低表达对人肝癌SMMC-7721细胞中的PHD3、HIF-1α蛋白表达水平的影响。结果 紫草素对SMMC-7721和L-02细胞的半抑制浓度（IC50）分别是8.0...     

扶正消瘤汤抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和诱导凋亡的实验研究

目的 探讨扶正消瘤汤对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和诱导凋亡的作用.方法 MTT法测定扶正消瘤汤对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖的影响;Elisa法测定肿瘤坏死因子(TNF-α)生成;流式细胞法检测扶正消瘤汤对人肝瘤细胞SMMC-7721凋亡的影响;免疫组化法测定bcl-2和bax表达.结果 扶正消瘤汤100 μg/ml、50μg/ml剂量组在12～84 h对人肝癌细胞SMMC-7721的生长有明显的抑制作用,24～48h对SMMC-7721细胞TNF-α生成均有明显的促进作用,对SMMC-7721细胞凋亡具有明显的促进作用,并随浓度和时间(24～72h)的增加凋亡率增加,活细胞减少;扶正消瘤汤高剂量组对SMMC-7721细胞bax表达有明显上调作用,浓度越大上调越明显.扶正消瘤汤高、低剂量组对SMMC-7721细胞bcl-2表达有明显下调作用,其中高剂量组与模型组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 扶正消瘤汤对肿瘤的治疗作用的机制可能与促进TNF-α生成有关,并且与抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、调控bax、bcl-2表达有关.     

化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210的表达

目的探讨不同浓度CoCl2对人肝癌细胞SMMC-7721乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）和miR-210表达的影响以及RNA干扰HIF-1α基因对miR-210表达的影响。方法采用Western blot法检测不同浓度CoCl2培养24 h后SMMC-7721细胞HIF-1α蛋白表达变化,实时定量PCR检测miR-210相对表达量。脂质体介导靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF转染SMMC-7721细胞后,乏氧培养24、48和72 h,分别采用Western blot法和实时定量PCR检测细胞HIF-1α蛋白表达变化和miR-210相对表达量。结果 50和100μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量与0μmol/L组相比,差异均无统计学意义（均P〉0.05）;150和200μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量均显著高于0μmol/L组（P〈0.05或P〈0.01）。转染质粒pGenesil-HIF后乏氧培养24、48和72 h,细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量显著低于阴性干扰组（均P〈0.01）。结论化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210表达明显上调,RNA干扰HIF-1α基因可明显下调乏氧细胞miR-210表达。     

E26特异性转化变异体4在体外促进肝癌细胞对索拉非尼和顺铂耐药

目的研究E26特异性转化变异体4（ETV4）对肝细胞癌（HCC）顺铂和索拉非尼耐药的影响。方法顺铂耐药HCC细胞株 SMMC-7721（对索拉非尼敏感）和HCC-LM3（对索拉非尼不敏感）经质粒转染诱导ETV4过表达或用siRNA干扰ETV4后，分别 用DMSO、索拉非尼（5 μmol/L）或顺铂（5 μmol/L）刺激48 h并收集总蛋白或总RNA。采用Western blotting、流式细胞术、EdU增 殖检测法检测处理后HCC细胞凋亡水平和增殖能力的变化。利用实时荧光定量PCR（q-PCR）技术检测11例HCC患者肿瘤组 织及配对的癌旁组织中ETV4 mRNA的表达水平。肝癌细胞株经干扰ETV4后，分别用DMSO、索拉非尼或顺铂刺激48 h，利用 q-RCR技术检测早期反应基因3（IER3）的mRNA表达水平。结果肝癌组织中ETV4 mRNA的表达水平显著高于对应的癌旁 组织。在两株肝癌细胞中过表达ETV4能显著减少索拉非尼或顺铂诱导的细胞凋亡，而干扰ETV4能显著增加索拉非尼或顺铂 诱导的细胞凋亡，并显著抑制索拉非尼或顺铂刺激下的细胞增殖能力。此外，在索拉非尼或顺铂的刺激下ETV4能调节IER3的 mRNA表达水平。结论ETV4过表达能促进HCC细胞对索拉非尼或顺铂产生耐药。     

Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究

目的 研究环状RNA hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的表达以及对肝癌细胞生物学功能的影响.方法 利用RT-qPCR检测环状RNA hsa_circ_0000711在肝癌细胞系的表达;通过小干扰RNA特异性敲低hsa_circ_0000711的表达;通过CCK-8实验检测肝癌细胞系的增殖情况;利用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡.Western blot检测下调hsa _circ _0000711后Cyclin D1、CDK4、 cleavaed Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达水平.结果 Hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC- 7721中明显高表达(P＜0. 05) .与对照组相比,hsa_circ_0000711干扰组的肝癌细胞增殖能力显著降低(P＜0. 05),处于G1期细胞增多(P＜0. 05),且凋亡细胞显著增加(P＜0. 05) .干扰hsa_circ_0000711的表达后,肝癌细胞中Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P＜0. 05),cleavaed Caspase 3蛋白表达量显著升高(P＜0. 05) .结论 Hsa_circ_0000711可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖.     

土大黄苷对人肝癌细胞SMMC-7721增殖和分化的影响

目的探讨土大黄苷(rhaponticin)对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖和分化的影响并初步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测土大黄苷对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖抑制率,镜下观察细胞形态改变,测定各组细胞SOD水平。结果不同浓度土大黄苷对SMMC-7721细胞的增殖抑制率随浓度和时间依赖性(P<0.01),并且药物浓度在100-250μmol/L的范围内显著抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖;药物在200μmol/L作用24h后,显微镜下可观察到肝癌细胞SMMC-7721的细胞形态和结构向正常肝细胞方向逆转;肝癌细胞在药物浓度为200μmol/L下作用12h、24h和48h后,各时间组肝癌细胞中SOD活力逐渐上升(P<0.05)。结论土大黄苷在体外可呈浓度和时间依赖性抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖并促进其分化。其作用机制可能与提高SOD的活性有关。     

肿瘤相关巨噬细胞通过诱导肝癌细胞自噬降低索拉菲尼的促凋亡作用

目的探讨索拉菲尼治疗肝癌耐药的分子机制,寻找逆转耐药新靶点。方法体外诱导THP-1细胞建立M2型肿瘤相关巨 噬细胞（TAMs）,免疫荧光鉴定M2型TAMs,将SMMC-7721细胞分为空白对照组、M2-TAMs共培养组、索拉菲尼组以及索拉菲 尼与M2-TAMs共培养联合处理组,CCK-8法检测M2-TAMs对索拉菲尼抑制SMMC-7721增殖的影响;Annexin V/PI双染法、 蛋白质免疫印迹法检测使用自噬抑制剂氯喹处理前后M2-TAMs对索拉菲尼促SMMC-7721细胞增殖、细胞凋亡的影响及细胞 凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白的表达量变化。结果索拉菲尼对肝癌细胞SMMC-7721作用48 h的IC50为2.25 μmol/L,索拉菲 尼对与M2-TAMs共培养（共培养给药组）48 h 的SMMC-7721的IC50为4.72 μmol/L。共培养给药组与单独给药组相比细胞凋亡 率明显下降（P<0.01）,Bcl-2 表达明显增加,Bcl-2/Bax 比值增加（P<0.05）,而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高（P< 0.001）,p62蛋白表达下调（P<0.05）,自噬水平明显增强。氯喹处理后能明显抑制共培养给药组的细胞增殖（P<0.05）,促进细胞 凋亡（P<0.05）,下调Bcl-2/Bax比值（P<0.01）。结论M2-TAMs可通过促进SMMC-7721细胞自噬,降低索拉菲尼对肝癌细胞的 增殖抑制作用,因此抑制自噬可能是逆转肿瘤微环境诱导索拉菲尼治疗耐药的新靶点。