核酶切割per基因所致的缓解吗啡成瘾作用研究

目的：探讨per基因与阿片类成瘾的相关性，进而寻找治疗阿片成瘾的基因戒毒疗法。方法：设计并合成特异性per锤头状核酶基因和per核酶靶mRNA组分基因，并分别重组人体外转录质粒，而后将经体外转录反应得到per核酶RNA和地高辛标记的per核酶靶mRNA组分。将转录产物混合，在不同条件下进行体外切割反应后，采用地高辛化学发光法检测per核酶的体外切割效率。小鼠脑室注射直接导入脂质体包裹的重组质粒pcDNA 3.1-per RZ DNA，按剂量递增法建立吗啡依赖动物模型，用纳洛酮催瘾，观察戒断反应的变化。结果：per核酶对per核酶靶mRNA组分的体外切割效率达到60％。重组质粒组小鼠的刻板跳跃、“湿狗”样抖动和打洞次数与空质粒组、生理盐水组相比明显减少，但并不抑制小鼠的体重下降。结论：per核酶具有体外定点切割per基因mRNA组分的活性。经小鼠吗啡成瘾模型检测，该重组质粒能成功转染活体小鼠脑细胞并在脑组织内稳定表达per核酶，发挥阻断per基因表达的作用，有效地减轻吗啡成瘾的戒断症状。     

Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究

目的 体外研究锤头型α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件。同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响。方法 将含α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ),经体外³²P标记转录后形成产物靶RNA。同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-gⅠ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录,产物(核酶)与各自的³²P-靶RNA按不同的条件混和反应,电泳后放射自显影观察结果。将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内,采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响。结果 两种核酶在37 ℃、42 ℃均能有效切割各自的靶RNA,对Mg²⁺浓度的要求范围较宽(10~20 mmol/L);反应温度从65 ℃逐渐降至并维持在37 ℃的条件下核酶切割活性显著提高。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低,胶原蛋白生成降低,胶原生成明显受抑制。结论 针对α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成。     

10-23型脱氧核酶对HBV S、C基因体外切割作用研究

目的:探讨10-23脱氧核酶(10-23 DRz)对HBV S基因及C基因体外转录产物的特异性切割作用.方法:分别构建含有HBV S基因或C基因的重组质粒,以线性化的重组质粒为模板,体外转录获得相应HBV S基因RNA及C基因RNA.设计并合成针对HBV S基因的DRz-hbvs-1和针对C基因的DRz-hbvc-1,观察其对靶RNA的体外切割作用.结果:DRz-hbvs-1及DRz-hbvc-1能对各自相应的靶RNA进行有效的特异性切割;无DRz对照组及反义寡核苷酸对照组均未见特异性切割.结论:10-23 DRz能特异性切割HBV S基因及C基因体外转录产物.     

Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究

目的 体外研究锤头型α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件。同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响。方法 将含α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ)，经体外^32P标记转录后形成产物靶RNA。同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-gⅠ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录，产物(核酶)与各自的^32P-靶RNA按不同的条件混和反应，电泳后放射自显影观察结果。将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内，采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响。结果 两种核酶在37℃、42℃均能有效切割各自的靶RNA，对Mg^2 浓度的要求范围较宽(10～20mmol／L)；反应温度从65℃逐渐降至并维持在37℃的条件下核酶切割活性显提高。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低，胶原蛋白生成降低，胶原生成明显受抑制。结论 针对α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成。     

c-myc基因核酶对靶mRNA的切割作用

目的：构建c—myc基因核酶及其靶mRNA的体外转录载体，探讨核酶对靶mRNA的体外切割作用。方法：通过计算机分析c—myc基因mRNA的二级结构，设计核酶基因序列，采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建入pGEM3Zf( )体外转录载体，将大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段克隆入pGEM7Zf(-)体外转录载体，分别进行体外转录获得核酶及靶mRNA。在含有Mg^2 的反应体系中，进行核酶对靶mRNA的体外切割反应。结果：经限制性内切酶酶切鉴定，核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，经DNA自动序列分析仪测序分析，大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段准确克隆入pGEM7Zf(-)载体。核酶对靶mRNA的体外切割活性约为64．5％。结论：该核酶具有切割靶mRNA的活性，可进一步用于细胞内和体内研究。     

EBV-LMP1 C端RNA的体外转录合成及其靶脱氧核酶的初步筛选

目的 探讨用体外转录方法制备EBV-LMP1 C端RNA并用该RNA对其靶脱氧核酶进行初步筛选.方法 用巢式PCR方法从绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中扩增EBV-LMP1 exon c,重组入pGEM-11zf载体,并用T7RNA聚合酶对其进行体外转录制备EBV-LMP1 C端RNA.根据该RNA的一、二级结构设计合成3种靶向10～23脱氧核酶,据体外剪切效率筛选高效特异的靶向脱氧核酶.结果 成功地构建含EBV-LMP1 exon c基因的重组质粒,用体外转录方法用1 μg质粒转录出40.25 μg高纯度的EBV-LMP1 C端RNA,有1种脱氧核酶DZ1对该RNA体外剪切效率达89%.结论 用T7RNA聚合酶体外转录方法成功制备了高纯度的EBV-LMP1 C端RNA,经体外剪切筛选出高效特异的1种脱氧核酶,为进一步研究奠定了基础.     

抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究

目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素。方法 利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶（ribozyme）,并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒,进行体外切割实验。结果 发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA。 结论 抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考,ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。     

抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用

目的: 设计合成血管内皮生长因子多位点核酶,探讨其对靶RNA的切割作用.方法: 利用计算机辅助设计针对VEGF165的3个单位点核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和联合型多位点核酶 (Rz123),构建其自剪切转录载体,观察多位点核酶对靶RNA的切割作用.结果: 构建的多位点核酶自剪切转录载体在体外转录中,顺式核酶发生了自身剪切,并释放出正确的目的核酶,多位点核酶可切割靶RNA,且效率高于单一核酶,其切割效率分别为 (37±10)% (Rz1), (51±8)% (Rz2 ), (68±15)% (Rz3) 和(88±11)% (Rz123).结论: 抗血管内皮生长因子多位点核酶体外可联合切割靶RNA,具有较高的生物活性.     

抗caspase-3核酶M1RNA的体外制备与活性鉴定

目的针对凋亡关键蛋白酶caspase-3设计核酶M1RNA-GS，对其体外制备及切割活性进行探讨。方法以RNase P催化亚基M1RNA为模板，PCR合成并克隆特异性针对人caspase-3的一组核酶pMl-GS716，pMl-GS337和pMl-GS235，^32P标记转录。应用RT—PCR方法从人外周血单个核细胞扩增底物caspase-3 mRNA目的片段，体外转录物作为靶RNA，核酶与靶RNA按1：1比例进行体外切割实验。结果pMl-GS 716和pMl-GS 337在37C均有切割活性，pMl-GS 716的切割效率为93％，pMl-GS 337为42％，而pMl-GS 235几无切割效应。结论体外制备的pMl-GS 716具有良好的特异催化切割活性，有望通过切割caspase-3而抑制细胞凋亡。     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂1的核酶高表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物.     

Site-specific cleavage of oncogene Ki-ras mRNA by ribozyme in vitro

Rasisaprotooncogeneencodingguaninenucleotidebindingprotein,ras--p21islocatedinthe.innerplasmamembraneandtransductssignalfromreceptortyrosinekinasetoraff.Ras--pZIproteinparticipatesintheregulationofcellgrowthanddifferentiation[lj.Mutationofras,Ki--rasinparticular,playsanimportantroleincellmalignanttransforming.ThemutantrateofKi--rasinhumanpancreaticadenocarcinomaisashighas95%['].So,blockingrasexpressionshouldbeapotentialmethodforcancertherapy.RibozymeisasmallcatalyticRNAmolecule.Recently,it…     

抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建

目的：构建一个含M1RNA、具有特异性抗慢性粒细胞性白血病（CML）细胞融合基因bcr/ablmRNA的真核表达载体，以用于CML的分子靶向治疗。方法：以pTK117为模板，通过PCR方法合成一个带有导引序列（GS）的M1RNA，再将PCR产物克隆到真核表达载体pNAV-1上，得到重组质粒pAVGS4，转化大肠埃希菌JM109，以碱裂解法小量抽提，酶切电泳鉴定，并测序鉴定。结果：以EcoRI和SalI酶切、1％的琼脂糖凝胶电泳显示在500和6500bp附近各有一条明亮的条带。应用PCR方法测序的结果与模板序列一致。结论：构建的pNAV-1经酶切和测序鉴定，与目标序列一致，含有核酶、具有抗bcr/abl mRNA的真核表达载体构建成功，预期可用于CML细胞株和原代细胞的实验研究。     

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.     

AIV PB2基因靶向性M1GS核酶的构建及其体外切割活性测定

目的 针对禽流感病毒(AIV)复制酶PB2亚基的基因构建具有靶向切割作用的M1GS核酶,为新型抗AIV反义药物的开发奠定基础.方法 基于大肠埃希菌的核糖核酸酶P(RNase P),根据AIV PB2基因的序列特征,设计一小段与之互补的引导序列GS,通过PCR技术将其共价连接至大肠埃希菌RNase P催化性亚基(M1 RNA)的3'末端,以构建靶向性M1GS核酶.通过体外切割试验测定M1GS核酶的活性.结果 构建了M1GS-T436、M1GS-C341两种M1GS核酶.体外切割实验证实,核酶M1GS-T436可对靶RNA片段产生特异性切割;核酶M1GS-C341虽可切割靶RNA片段,但可能属于非特异性切割.结论 成功构建并筛选出一种具有显著体外切割活性的M1GS核酶(M1GS-T436),为今后进一步研究其胞内及体内抗病毒活性奠定了基础.     

紧密连接蛋白claudin-1基因的克隆和大肠癌细胞表达载体的构建

目的 研究claudin-1在大肠癌中的作用,构建包含claudin-1基因编码区域的重组质粒.方法 从人类大肠癌细胞株SW620用Trizol提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得DNA,限制性内切酶进行酶切、T4连接酶进行连接:将PCR产物插入绿色荧光蛋白pEGFP-C1载体,然后转染进人人类大肠癌细胞株SW480.结果 重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析,显示序列正确,在SW480中主要为膜表达.结论 成功构建了claudin-1/pEGFP-C1重组质粒,并能在人类大肠癌细胞中表达.     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

Prokaryotic expression of Chinese bovine enterokinase catalytic subunit

Background To express in vitro the bovine enterokinase catalytic subunit (EKL) protein, which could be used in the future for the cleavage and purification of fusion proteins.Methods Bovine enterokinase catalytic subunit cDNA was obtained by RT-PCR from the duodenal mucosa of a bovine obtained at a wholesale market, and then cloned into a pUCmT cloning vector and sequenced. The desired gene fragment was inserted into a pET39b expression plasmid and the recombinant vector pET39b-EKL was transformed into E. coli BL21 (DE3). Protein expression was induced using IPTG. The recombinant DsbA-EKL was purified with His·Tag affinity chromatography, and its bioactivity was analyzed.Results Compared with the sequence deposited in GenBank, the sequence of the EKL gene cloned in the present study is correct. It was also confirmed that the nucleotide sequence of expression plasmid pET39b-EKL was correct at the conjunction site between the recombinant DNA 5’terminal multi-cloning site and the recombinant fragment. SDS-PAGE analysis indicated that the target product was about 65 kDa and represented 28% of total cell protein. Purified recombinant protein was obtained by metal chelating chromatography using a Ni-IDA resin. After desalting and changing the buffer, the crude kinase was incubated at 21℃ overnight and shown to have a high autocatalytic cleavage activity.Conclusion The EKL gene from a Chinese bovine has been cloned successfully and expressed. This investigation has layed the foundation for future enterokinase activity research and for further large-scale application of expression products.     

小鼠ACE2基因的克隆和体外表达以及序列分析与组织分布

目的:深入研究血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在心血管疾病发病机理中的作用及在高血压基因治疗中的应用,克隆和体外表达小鼠ACE2基因,并进行核苷酸和氨基酸序列分析和组织分布特征研究.方法:采用RT-PCR方法,从小鼠肾组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,TA克隆到pGEM-T easy载体,亚克隆到pcDNA3.1 载体,构建重组真核表达质粒pmACE2,测序鉴定.采用脂质体法将pmACE2转染Cos7细胞,分别用RT-PCR和SDS-PAGE检测ACE2的转录和表达.CLUSTALX 1.8生物软件分析小鼠和大鼠及人ACE2蛋白的多序列比较.采用RT-PCR技术研究小鼠ACE2组织分布的特异性.结果:①RT-PCR扩增片段约2.6 kb,重组真核表达质粒pmACE2测序结果表明,克隆片段存在A701G、T1102C和T1330C 3处变异,其序列与以往报道不一致,cDNA全长为2 397 bp,而与NCBI Refseq数据库(XM-136130)中cDNA全长1 902 bp不符;②SDS-PAGE显示pmACE2表达产物的相对分子量约80 kD;③氨基酸序列分析表明,小鼠ACE2主要由N末端的信号肽序列(第1-18位残氨)、含有锌结合位点保守序列HHEMGHIQ(第373-380位残氨)的催化结构域和跨膜结构域(第738-765位残氨)组成;④小鼠ACE2与人有84%的相似性,与大鼠有90%的相似性,三者同源;⑤ACE2在肺、心和肾组织中大量表达,在睾丸和肝组织中也有表达.结论:成功克隆并体外表达了小鼠ACE2基因,不同物种ACE2组织分布的特异性不尽相同.