乳腺癌SLN中CD25+T及NK细胞的免疫组化研究

目的分析乳腺癌SLN中CD25^＋ T及NK细胞的变化规律。方法从2001年4月～2003年6月所进行的乳腺癌SLNB病例中，选择应用CK19单抗检测到SLN具有微转移的病人12例，并随机选择无转移的9例．HE有转移的10例共82个SLN。将82个SLN分为无转移、微转移及转移组；选择CD25及CD56单抗，采用免疫组化SABC的方法，计数5个高倍视野下阳性染色细胞数和淋巴细胞总数的比值，取其平均值，得出阳性细胞百分比率。结果82个SLN中未转移35个，微转移20个，转移27个；3组淋巴结中CD25^＋细胞占总淋巴细胞的百分比率在无转移组与微转移组间差异无统计学意义（P=0．260）、而在微转移组与转移组间差异有显著性（P〈0.01）。3组SLN中NK细胞占总淋巴细胞的百分比率差异无显著性（F=0.755，P〉0.05）。结论在SLN无转移和微转移状态下，CD25^＋细胞的数量无明显变化，而一旦出现HE转移，则CD25^＋细胞的数量显著增加。SLN转移与否，NK细胞的数量无明显变化。     

树突状细胞在乳腺癌组织中的表达

目的通过观察树突状细胞(DC)在人乳腺癌组织中的阳性细胞数和表达强度,探讨DC与乳腺癌发生发展的关系。方法利用CD1c作为DC的特征性标志分子,用免疫组织化学方法观察20例人乳腺浸润性导管癌组织及相对正常乳腺组织中DC的分布和形态学变化。同时观察了CD4+T细胞和CD8+T细胞。结果乳腺癌组织中树突状细胞的CD1c表达强度较相对正常乳腺组织明显减弱(P<0.05);CD1c+DC数量较相对正常乳腺组织明显减少(P<0.05)。乳腺癌组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量与相对正常乳腺组织相比均减少(P<0.05)。结论DC在人乳腺癌组织中的表达总量下降,提示DC在抗乳腺癌的免疫反应中可能起重要作用。     

全麻下乳腺癌根治术对患者免疫系统的影响

目的:探讨全凭静脉麻醉和乳腺癌根治术对术前化疗与非化疗患者围术期T淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞(NK细胞)的影响,并通过测定CK19mRNA来判断乳腺癌细胞的微转移情况.方法:随机选择术前化疗与非化疗乳腺癌患者各20例,分为两组:Ⅰ组为术前未化疗组,Ⅱ组为术前化疗组.分别于麻醉前、术毕和术后72h抽取外周血11ml测定T细胞亚群、NK细胞的数量及CK19mRNA的表达情况.结果:与麻醉前相比,两组术毕和术后72h CD3 、CD8 和NK细胞均下降,其中Ⅰ组CD8 和NK细胞两个时点均下降明显(P<0.05),Ⅱ组术毕和术后72h CD8 及术后72h NK细胞下降明显(P<0.05),两组间比较差异无显著性.与麻醉前相比,两组术毕和术后72h CD4 及CD4 /CD8 均升高,其中Ⅰ组术毕和术后72h及Ⅱ组术毕CD4 /CD8 升高明显(P<0.05),Ⅱ组术后72h CD4 /CD8 显著升高(P<0.01).两组均有3例患者检测到CK19mRNA的表达,且Ⅱ期乳腺癌患者的表达较Ⅰ期显著增高(P<0.05).结论:全凭静脉麻醉和乳腺癌根治术对术前化疗与非化疗患者的免疫系统有一定的抑制作用,而这种抑制作用与患者术前是否进行辅助化疗无关;同时乳腺癌患者存在微转移迹象.     

慢性乙型肝炎患者肝脏局部免疫与外周血免疫关系研究

目的 通过检测慢性乙型肝炎患者外周血及肝组织内CD4 T细胞和CD8 T细胞的数量及功能,比较二者之间的联系.方法 (1)用流式细胞仪检测60例HBV感染者和20例正常人外周血中T细胞亚群的数量.(2)选取60例慢性肝炎患者的肝脏石蜡标本.免疫组化方法检测CD4 T、CD8 T淋巴细胞和树突状细胞,分析免疫细胞的类型、数目及分布情况,并作相应比较.结果 (1)HBV感染组外周血T细胞亚群测定值中,CD4 T细胞和CD T/CB8 T比值明显低于对照组(P<0.05);CD8 T细胞升高,明显高于对照组(P<0.05);(2)免疫组化结果显示CD4 T细胞多见于汇管区,CD4 T细胞数量少于CD8 T细胞数量.树突状细胞形态不规则,绝大部分DC分布于坏死灶和汇管区间质中与淋巴细胞伴行,肝细胞内一般不常见,坏死灶越多,淋巴细胞浸润越多的病例中DC细胞也越多.外周血CD4 T、CD8 T的数量与肝脏局部免疫细胞的分布数量不具有相关性(r=0.95;r=0.94).结论 评价慢性肝炎肝脏免疫微环境状况应当综合评价免疫细胞的类型、亚型和功能状态及相互作用等多种因素,在分析、判断疾病进程和治疗上有一定意义.     

免疫细胞在婴幼儿血管瘤组织中的分布及其变化

目的：观察婴幼儿血管瘤中免疫细胞的分布及其变化过程.方法：52例婴幼儿血管瘤标本,以CD3、CD8、S-100分别作为T细胞、细胞毒性T细胞（Tc细胞）和树突细胞（DC）的标记性抗原,采用免疫组化染色观察上述免疫细胞在血管瘤组织中的分布.结果：①最早期血管瘤组织中基本无CD3^＋T细胞;增殖中期CD3^＋T细胞增多,CD8^＋T细胞仍然稀少;增殖晚期CD3^＋T细胞很多,CD8^＋T细胞也增多;消退早期在微血管周围仍散在分布少量CD3^＋T细胞和CD8^＋T细胞;消退中期和消退完成期血管瘤组织中有少数CD3^＋T细胞,而CD8^＋T细胞很少.②增殖早期血管瘤组织中散在分布少量DC;增殖中期和晚期DC数量显著增多.消退早期之后,DC数量迅速减少,以至基本消失.结论：T细胞及其亚群和DC的分布及其功能变化,与血管瘤病理演变过程有密切联系,婴幼儿免疫系统功能逐渐成熟,可能是血管瘤消退的主要原因之一.     

大肠癌组织中抗原递呈细胞改变的研究

目的观察大肠癌组织局部抗原递呈细胞及淋巴细胞、CD8 的淋巴细胞数量的改变情况,探讨肠癌细胞逃避免疫监视的机制。方法用免疫组化的方法检测65例大肠癌组织、切端黏膜局部组织中树突状细胞(DC)及各类免疫细胞亚群数量,结合肠癌的临床病理资料进行综合分析。结果大肠癌组织中S-100阳性的DC数量低于切端黏膜,差异有显著统计学意义(=0.001);在肿瘤不同的Dukes分期及分级中,S-100阳性的DC数量比较差异无统计学意义。肠癌组织中淋巴细胞总数与其相应的切端黏膜细胞总数比较,差异无统计学意义(=0.066);淋巴细胞在高分化肠癌组织与中分化肠癌组织中数量比较,差异有统计学意义(=0.015),高分化肠癌组织与低分化肠癌组织中数量比较,差异有显著统计学意义(=0.006);在不同的Dukes分期中淋巴细胞总数比较,差异无统计学意义。肠癌组织中CD8 淋巴细胞数量与其相应的切端黏膜细胞数比较,差异无统计学意义(=0.328);在肿瘤不同的Dukes分期及分级中,CD8 淋巴细胞数量比较差异无统计学意义。结论大肠癌组织中局部的DC数量减少,反应了肿瘤组织抗原递呈功能降低,可能是肠癌细胞逃避机体的免疫监视的重要机制。     

T细胞、CD4~+T细胞与转移复发性三阴性乳腺癌的预后关系

目的探讨转移复发性三阴性乳腺癌患者外周血中T细胞及其亚群(CD4~+T细胞、CD8~+T细胞)减少与患者中位无进展生存(mPFS)及中位总生存(mOS)间的关系。方法 133例转移复发性三阴乳腺癌患者一线化疗前,用流式细胞仪检测患者外周血T细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞的数目。对患者进行为期5年的随访,探讨T细胞及其亚群与转移性三阴性乳腺癌的预后间的关系。结果转移复发性三阴性乳腺癌患者m PFS、mOS长短与外周血中T细胞及CD4~+T细胞数量相关(P0.05);mPFS、mOS长短与CD8~+T变化无关(P0.05)。结论转移复发三阴性乳腺癌患者的外周血T细胞数量和CD4~+T数量可作为判断患者预后的指标。     

外周血淋巴细胞亚群监测对复发转移性乳腺癌的预测及预后价值

目的：检测化疗前、化疗2周期评价疗效时复发转移性乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群比率,探讨外周血淋巴细胞亚群比率与患者化疗近期疗效及预后的关系。方法：采用流式细胞术检测83例复发转移性乳腺癌患者化疗前、化疗2周期评价疗效时外周血中CD3+ T细胞、CD3+/CD4+ T细胞、CD3+/CD8+ T细胞、CD3-/CD16+56+自然杀伤细胞（natural killer,NK）细胞、 CD3+/CD16+56+ T细胞、CD19+ B细胞、CD4+/CD25+调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）细胞、CD8+/CD28- T细胞和CD8+/CD28+ T细胞比率,结合临床病理进行统计。结果： 疾病控制患者（部分缓解+稳定）化疗后CD4+/CD25+ Treg细胞比率变化较疾病进展患者显著下降（P=0.034）。化疗后Treg细胞比率变化显著影响患者总生存期（P<0.05）,化疗后Treg细胞比率降低的患者较升高的患者总生存期显著延长,分别为23.5及9.4个月。结论： 复发转移性乳腺癌患者化疗后Treg细胞比率降低者化疗近期疗效及预后较好。     

化疗对肿瘤患者淋巴细胞亚群的影响

目的探讨肿瘤患者化疗前后T淋巴细胞及亚群含量的变化及临床意义。方法采用流式细胞仪技术,分别对治疗组和对照组外周血T淋巴细胞及亚群进行检测计数。结果200例肿瘤患者CD3＋T淋巴细胞、CD4＋T淋巴细胞、NK细胞的数量以及CD4/CD8比值均明显低于健康人群。其中CD8＋T淋巴细胞的比例明显高于健康人群,差异具有统计学意义（P〈0.05）。有淋巴细胞转移组CD3、CD4、CD4/CD8及NK细胞数量较无淋巴细胞转移组明显下降,CD8显著升高,差异有统计学意义（P〈0.05）。化疗2个周期后。外周血CD3、CD4、NK细胞含量以及CD4/CD8比值化疗后较化疗前降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）;化疗前后CD8均值变化不大（P〉0.05）。结论肿瘤患者机体的免疫状态与病情发展、临床分期密切相关,化疗可明显抑制肿瘤患者机体的免疫功能。     

乳腺癌患者外周血T淋巴细胞和NK细胞水平分析

目的 探讨乳腺癌患者手术前后外周血淋巴细胞的变化及其与预后的关系.方法 采用流式细胞术检测59例无淋巴结转移乳腺癌患者手术前后外周血CD3+、CD4+、CD8+、自然杀伤细胞(NK)、CD19+细胞水平.随访1年,观察患者是否复发,并测定上述指标.结果 术后CD19+细胞水平较术前明显下降(P＜0.05),手术前后CD4+、CD8+、CD3+、NK细胞水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).术后随访1年,复发10例,未复发49例.术后复发组的术前、术后外周血CD4+细胞水平明显低于未复发组(P＜0.05),CD8+、NK和CD19+细胞水平明显高于未复发组(P＜0.05),但两组CD3+细胞水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 监测乳腺癌患者手术前后外周血T淋巴细胞和NK细胞水平,能客观地反映患者机体的细胞免疫功能状态、宿主的免疫细胞数量与功能异常,对判断乳腺癌患者术后复发及预后有重要的参考价值.     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

肺结核患者外周血NKT细胞、NK细胞、T淋巴细胞亚群的变化及意义

目的了解肺结核患者外周血NKT细胞、NK细胞和T淋巴细胞亚群的变化及其意义。方法采用流式细胞仪抗体双标法检测472例肺结核和非结核患者外周血NKT细胞（CD3＋CD16＋CD56＋）、NK细胞（CD3-CD16＋CD56＋）及T淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8及CD4/CD8）的表达率,并进行分析。结果肺结核患者的NK细胞和NKT细胞的表达水平显著低于非结核患者,T细胞亚群CD4在肺结核患者中的表达显著高于非结核患者。肺结核患者不耐药组NK细胞和NKT细胞的表达率明显高于耐药组（F值分别为7.926、5.689,P〈0.001）。初治病例CD4、CD4/CD8显著高于复治病例（t值为-2.179、-2.402;P值为0.030、0.017）,初治病例CD8低于复治病例（t=3.257,P=0.001）。NKT细胞、NK细胞在初治和复治病例中的分布差异无统计学意义。NKT细胞、NK细胞和T淋巴细胞亚群在不同病灶范围分组之间分布差异无统计学意义。NK细胞、NKT细胞、CD4、CD8以及CD4/CD8在肺部有无空洞及空洞数量分组之间分布差异有统计学意义,即NK细胞、NKT细胞数、CD4/CD8、CD8随着空洞累及范围的增加而降低,CD4则随空洞累及范围的增加而升高。结论肺结核患者NKT细胞和NK细胞的表达受到了抑制,且NK细胞和NKT细胞的表达率随着耐药及耐药程度的加重而降低,随着肺结核空洞累及范围的增加机体免疫进一步失衡,提示结核病尤其是耐药结核病采用免疫调节剂辅助治疗的必要性。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨胚胎干细胞（ＥＳ）向神经细胞定向分化发育的可能性。方法 ＥＳ－Ｄ３在无小鼠白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）存在的条件下培养ＥＳ细胞４ｄ,形成ＥＳ集落（即胚胎样小体）,经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上。结果 上述细胞表达ＭＡＰ－２和ＧＦＡＰ蛋白。ＲＴ－ＰＣＲ分析进一步证明这些细胞能表达γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）γ亚单位和酷氨酸羟化酶以及脑因子－１神经相关基因。结论 ＥＳ细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征。方法采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增。透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4α、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达。结果大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸。细胞体外培养可达40 d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形。透射电子显微镜下可见细胞直径5～10μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网。免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强。结论大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜...     

大鼠肝脏卵圆细胞干细胞特性的研究

目的 探讨大鼠肝脏卵圆细胞体外培养扩增及其干细胞特征.方法 采用2-乙酰氨基芴/四氯化碳方法建模,胶原酶灌流和流式细胞术分选纯化卵圆细胞,进行培养和扩增.透射电子显微镜观察肝脏卵圆细胞的超微结构,免疫细胞化学法检测干细胞标志物OV-6、c-kit和Thy-1.1的表达;RT-PCR法检测卵圆细胞内c-kit、肝细胞标志物(HNF-4a、AFP)和胆管细胞标志物(CK-7、CK-19)的基因表达;Western blotting法检测OV-6和AFP蛋白的表达.结果 大鼠肝脏组织可见明显的卵圆细胞增生,成簇分布,逐渐向肝实质内延伸.细胞体外培养可达40d以上,细胞体积较小,多呈圆形和卵圆形.透射电子显微镜下可见细胞直径5～10 μm,细胞核大,胞质少,核/质比例大,细胞器少,仅见少量线粒体和内质网.免疫细胞化学检测显示,细胞表面OV-6、c-kit和Thy-1.1染色阳性;RT-PCR检测显示,卵圆细胞内有c-kit、HNF-4α、AFP、CK-7和CK-19基因表达;Western blotting检测显示,OV-6蛋白持续表达,AFP蛋白表达逐渐增强.结论 大鼠肝脏卵圆细胞体外可大量扩增并且保留其干细胞和双向分化潜能特性.     

哺乳动物内耳再生毛细胞前体细胞来源研究

目的探讨哺乳动物内耳再生毛细胞前体细胞的可能来源。方法取出生1d大鼠的椭圆囊,嗜热菌蛋白酶处理,消化法原代培养。在倒置显微镜下,对椭圆囊感觉上皮细胞（USEC）的形态、生长特征进行观察;透射电镜及免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18、波形蛋白;免疫细胞化学法及RT—PCR检测支持细胞标记物p27kipl mRNA及毛细胞的特征性标记物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Vlla mRNA的表达,进而鉴定USEC上皮细胞来源。结果原代培养的USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞问连接紧密,形成单层时呈“铺路石样”外观,可见“dome”结构;表达细胞角蛋白,但不表达波形蛋白,细胞微绒毛丰富,细胞问连接紧密。原代培养的USEC表达支持细胞标记物p27kipl mRNA及毛细胞的特征性标志物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Vlla mRNA。结论原代培养的USEC可以产生毛细胞样细胞,而且能表达支持细胞标记物,表明其来源为支持细胞。椭圆囊感觉上皮的支持细胞可能是毛细胞再生的前体细胞之一。     

原核和真核细胞表达HBeAg的应用研究

目的：将原核细胞和真核细胞分别克隆表达生产的HBeAg,经适当纯化后进行检测分析,并在乙型肝炎抗HBe检测中进行应用和比较。方法：分别用大肠杆菌和家蚕细胞表达生产HBeAg,并用Saphacryl S-200柱层析进行纯化;紫外分光光度法测定表达产物的蛋白含量;EIA法测定HBeAg和HBcAg效价及评估HBeAg的应用效果。结果：原核细胞HBeAg：比活性为10000／mg,HBeAg/HBcAg＝50,用于抗HBe的检测时特异性为96％,灵敏度符合国家卫生部panel要求,真核细胞HBeAg：比活性为160000／mg,HBeAg/HBcAg＝5000,用于抗HBe的检测时特异性为100％,灵敏度高于国家卫生部panel要求的1－2个滴度。结论：真核细胞表达的HBeAg比活性高HBcAg含量低,在抗HBe检测时的应用效果优于原核细胞。     

缺氧激发卵巢癌上皮性肿瘤细胞中的干细胞向内皮样细胞分化

 目的 在缺氧状态下对卵巢癌上皮性肿瘤细胞SKOV-3和ES-2诱导的内皮样细胞（endothelial-like cell,EC-like）进行鉴定,寻找卵巢癌上皮性肿瘤干细胞（tumor stem cell,TSC）的线索。方法 建立Matrigel三维培养系统,在1%O₂缺氧条件下对卵巢癌上皮性肿瘤细胞SKOV-3和ES-2进行缺氧诱导。应用免疫荧光双重标记、透射电镜等技术对SKOV-3和EC-2来源内皮样细胞的表面特异性抗原、超微结构和乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low -density lipoprotein,ac-LDL）吞噬功能进行鉴定。结果 培养7天后,SKOV-3内皮样细胞可以表达Flk-1、AC133及vWF;细胞出现空泡样变化,表面出现微绒毛样突起,极少数细胞出现质膜包裹的颗粒。ES-2内皮样细胞可以表达Flk-1、CD34;细胞出现空泡样变化,表面出现微绒毛样突起,极少数细胞出现质膜包裹的颗粒;部分Dil阳性细胞,具有吞噬ac-LDL功能。常氧状态下无上述变化。结论 卵巢癌肿瘤细胞具有干细胞（stem cell,SC）特征：SKOV-3和ES-2内皮样细胞可能来源于卵巢癌上皮性肿瘤细胞中的SC。缺氧的压力下卵巢癌SC先向血管内皮样细胞分化,说明卵巢癌SC是一种可向内皮细胞（endothelial cell,EC）分化的肿瘤源性EC前期细胞。缺氧激发下卵巢癌SC分化的EC-like更类似内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）而非EC。