哺乳动物耳蜗感觉上皮细胞长期培养体系的建立及临床意义

目的建立哺乳动物耳蜗感觉上皮细胞（CSEC）长期培养体系,为内耳毛细胞再生、分子及基因研究提供细胞来源。方法取1d龄wistar大鼠耳蜗感觉上皮作组织块培养,有限稀释法纯化并得到CSEC单克隆细胞系。胰蛋白酶＋胶原酶消化培养传代,传25代。取第25代CSEC,在倒置显微镜、透射电镜下对CSEC的生长特征、形态结构进行观察;免疫细胞化学检测细胞角蛋白18、波形蛋白,鉴定CSEC细胞来源。免疫荧光细胞化学、RT—PCR检测毛细胞标志物Brn．3a、Calretinin及AchRa9、MyosinVllamRNA的表达,鉴定CSEC特征。结果第25代CSEC均呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,单层时呈“铺路石样”外观,可见“dome”结构;其可表达细胞角蛋白和不表达波形蛋白,微绒毛丰富,细胞间连接紧密,提示其为上皮细胞来源：并可表达毛细胞特征性标志物Brn3．a、Calretinin及AchRa9、Myosin Vlla mRNA。结论本实验成功建立了哺乳动物CSEC长期培养体系。长期培养的CSEC性状未发生明显改变,具有毛细胞前体细胞的特征。这为毛细胞再生的机制及内耳分子、基因研究提供了稳定的细胞来源。     

耳蜗前体细胞体外培养和诱导分化的实验研究

目的通过体外定向诱导耳蜗前体细胞分化，明确耳蜗前体细胞的位置取材，来源及增殖分化特性．建立完善的耳蜗前体细胞的培养体系。方法取耳蜗的Corti器位置，利用无血清培养和单细胞克隆技术，进行细胞培养，在相差显微镜下观察细胞形态及生长状况，并用神经巢蛋白（nestin）、溴脱氧尿嘧啶（Brdu）、MyosinⅦA、P27^KIP1等免疫荧光方法。鉴定耳蜗前体细胞和由耳蜗前体细胞分化而来的内耳毛细胞和内耳支持细胞。同时进行细胞计数。结果从新生大鼠耳蜗分离的组织．经原代和传代培养后，可获得大量未分化，悬浮生长的Nestin阳性细胞团，并具有增殖的能力，诱导分化后的细胞经免疫荧光双标实验可表达Brdu、MyosinⅦA和P27^KIP1阳性。流式细胞仪细胞计数后，发现前体细胞向内耳毛细胞诱导分化的数量较少，向支持细胞分化的较多。结论从新生大鼠耳蜗分离的细胞是具有自我更新和分化潜能的前体细胞，可诱导分化为内耳毛细胞和内耳支持细胞。     

兔Tenon’s囊组织原代成纤维细胞分离培养与鉴定

目的:改良和补充兔Tenon’s囊组织原代成纤维细胞的分离培养、鉴定方法,为开展抗青光眼术后滤过泡瘢痕化的药物研究提供成熟的原代成纤维细胞。方法:应用组织块培养法,无菌条件下摘取组织,机械剪碎,于含10%胎牛血清的DMEM中培养,显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法鉴定,实时荧光定量PCR法检测细胞波形蛋白、角蛋白的mRNA水平。结果:分离培养的细胞具有成纤维细胞形态,7-10d从组织块周围大量爬出,15d铺满培养皿;免疫荧光法鉴定显示,波形蛋白表达阳性,角蛋白阴性表达;实时荧光定量PCR检测出细胞中波形蛋白mRNA水平远远高于角蛋白。结论:改良和补充了兔Tenons囊组织成纤维细胞原代培养与鉴定方法,为后续青光眼术后滤过泡抗瘢痕化的药物研究奠定基础。     

组织块法培养人胃成纤维细胞及其结缔组织生长因子的表达

[目的]探索人胃成纤维细胞体外培养的技术方法及其结缔组织生长因子表达情况。[方法]采用组织块贴壁培养法进行人胃成纤维细胞体外培养并传代,倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态,并用免疫细胞化学法检测培养细胞的波形蛋白与角蛋白表达。用RT-PCR法检测人胃成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达,免疫细胞荧光染色法检测人胃成纤维细胞CTGF蛋白表达情况。[结果]人胃成纤维细胞培养成功传代,表现为长梭形或星形细胞,免疫细胞化学鉴定细胞波形蛋白阳性,角蛋白阴性。RT-PCR法与免疫细胞荧光染色法证实体外培养的人胃纤维细胞表达CTGF。[结论]组织块法培养的人胃成纤维细胞可在体外稳定培养、传代,人胃成纤维细胞能合成CTGF。     

模拟子宫微环境诱导大鼠胎盘间充质干细胞向子宫内膜上皮细胞方向分化的实验研究

目的 模拟子宫微环境诱导大鼠胎盘间充质干细胞（PMSCs）向子宫内膜上皮细胞方向分化。方法 原代培养大鼠PMSCs及传代,绘制细胞生长曲线,制备子宫内膜条件培养液,用子宫内膜条件培养液和雌激素（β-雌二醇）进行体外诱导分化PMSCs;免疫荧光化学法检测细胞波形蛋白和角蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测上皮细胞标记细胞角蛋白7（CK-7）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）、上皮膜抗原（EMA）的基因表达;Western blotting检测波形蛋白和角蛋白表达量。结果 实验组CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA相对表达量高于对照组（P <0.05）;实验组波形蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）;实验组角蛋白相对表达量高于对照组（P <0.05）。结论 使用子宫内膜诱导培养液和雌激素能够促进大鼠PMSCs向子宫内膜上皮细胞方向分化,其作用显著,体外模拟子宫微环境在PMSCs向子宫内膜上皮细胞方向分化中有着重要的作用。     

酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞

目的建立用酶消化组织块培养兔牙周膜细胞的方法,为下一步的研究做好基础。方法取成年新西兰大白兔牙周膜组织,通过酶消化组织块法原代培养兔牙周膜细胞。取第4代免牙周膜细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源。结果酶消化组织块法成功培养出兔牙周膜细胞,细胞形态呈梭形。免疫细胞化学鉴定波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,说明细胞为中胚层来源的牙周膜成纤维细胞。结论酶组织消化块法可以很好地进行兔牙周膜细胞体外培养,且此方法简单易行。     

Morphological development process of periphery vestibular organs in inner ear and expression of myosin Ⅵ in C57BL/6 mice

目的 探讨C57 BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ在该过程中的表达.方法 选择从E10到E20每个时间点的孕鼠,取E10～E17的胚胎头、E18～E20的胚胎内耳,通过冰冻连续切片、HE染色及免疫荧光观察小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ抗体标记阳性毛细胞出现的时间.结果 小鼠内耳前庭末梢器官发育早、过程短,E10是听囊,E11已经能区分出背侧较大的前庭囊和腹侧较小的耳蜗囊,E12的前庭囊和耳蜗囊区分已很明显,并且出现内淋巴囊和管、上和后半规管始基,E13可见到上和后半规管壶腹嵴始基,出现水平半规管始基和椭圆囊始基,E14形成球囊和水平半规管壶腹嵴始基,E15椭圆囊、球囊、膜半规管初具成熟形态,所有囊斑、壶腹嵴基本形成,E18形态发育基本完成.Myosin Ⅵ标记阳性表达的毛细胞在E15的所有壶腹嵴、囊斑里出现,未见支持细胞表达Myosin Ⅵ.结论 MyosinⅥ在E15开始表达,这个时期可能是毛细胞成熟的关键时期.     

胎鼠听囊细胞体外培养研究

目的:了解哺乳动物听觉细胞的来源,探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化. 方法:取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养,用免疫细胞化学方法,分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F-肌动蛋白和calretinin染色观察细胞特征;BrdU染色观察细胞增殖. 结果:培养的细胞在体外进行分化和增殖,细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种. 对细胞角蛋白和F-肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性. 在原代培养就出现calretinin染色明显阳性的细胞. 传代后结果仍为阳性着染,但强度减弱. BrdU染色显示培养细胞具有明显的增殖活性. 本研究共传8代,历时4 mo,细胞形态维持稳定. 结论:胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞. 本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及Myosin Ⅵ的表达

目的探讨C57BL/6小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ在该过程中的表达。方法选择从E10到E20每个时间点的孕鼠,取E10～E17的胚胎头、E18～E20的胚胎内耳,通过冰冻连续切片、HE染色及免疫荧光观察小鼠内耳前庭末梢器官的形态发育过程及MyosinⅥ抗体标记阳性毛细胞出现的时间。结果小鼠内耳前庭末梢器官发育早、过程短,E10是听囊,E11已经能区分出背侧较大的前庭囊和腹侧较小的耳蜗囊,E12的前庭囊和耳蜗囊区分已很明显,并且出现内淋巴囊和管、上和后半规管始基,E13可见到上和后半规管壶腹嵴始基,出现水平半规管始基和椭圆囊始基,E14形成球囊和水平半规管壶腹嵴始基,E15椭圆囊、球囊、膜半规管初具成熟形态,所有囊斑、壶腹嵴基本形成,E18形态发育基本完成。MyosinⅥ标记阳性表达的毛细胞在E15的所有壶腹嵴、囊斑里出现,未见支持细胞表达MyosinⅥ。结论 MyosinⅥ在E15开始表达,这个时期可能是毛细胞成熟的关键时期。     

新生猕猴肝脏上皮前体细胞无血清培养体系的建立

目的建立猕猴肝上皮前体细胞的无血清体外培养体系。方法取健康新生猕猴肝脏,剪切、消化、离心后在胶原培养体系中用含Ca^2＋的培养基培养,选取多角形细胞集落,在不同胞外基质中分离培养,应用细胞免疫荧光染色、细胞化学染色、RT—PCR、靛青绿吸收染色方法进行细胞表型和双向分化潜能鉴定。结果多角形细胞团块在层粘连蛋白或大鼠鼠尾胶原上增殖传代形成集落,并特异性地表达肝干细胞的特异性标志物,不表达成熟肝细胞标志。经地塞米松和抑瘤素诱导分化后表达成熟肝细胞的标志特征,在小鼠胎儿成纤维饲养层,表达胆管细胞的特异性标志蛋白并形成胆管样结构。结论利用无血清培养体系从新生猕猴肝组织中分离到具有肝前体细胞特性的多角上皮细胞,这一研究模型的建立可为人类肝脏疾病的研究和细胞治疗提供临床前的评估平台。     

小鼠肝纤维化肝脏细胞上皮-间质转换的研究

目的探讨小鼠肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）时,肝细胞发生的上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transitions, EMT）的变化。方法建立小鼠CCl4诱导HF模型,随机分为模型组与正常对照组,每周2次,分别于第2、4、6、8、10、12周分批处死大鼠。用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养小鼠肝细胞,免疫荧光方法对细胞表型进行鉴定,采用H．E及Massion染色等观察E-钙粘附素（E-cadherin,E-cad）、成纤维细胞特异性蛋白-1（ fibroblast specific protein-1, FSP-1 ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscleactin,α-SMA）的表达。用免疫荧光显微镜及激光共聚焦定位分析观察EMT蛋白[FSP-1、白蛋白（albumin）、α-SMA、波形蛋白（vimentin,VM）、胶原I（collagen I）、纤维连接蛋白（fibronectin,FN）、N-钙粘附素（N-cadherin,N-cad）、E-cad]表达情况。结果小鼠HF时,肝细胞存在EMT现象。H-E、Massion染色及免疫荧光均显示,随着HF的程度加重,小鼠肝上皮细胞标志（E-cad、Albumin）逐渐减低,肝间质细胞标志（N-cad、FSP-1、VM、Collagen I、FN及α-SMA）逐渐升高（P〈0．05）。结论实验性小鼠HF的进程中,肝细胞发生EMT现象。     

霍乱弧菌蛋白酶PrtV对霍乱弧菌溶细胞毒素引起人肠上皮细胞炎性反应的修饰

目的研究霍乱弧菌分泌的蛋白酶PrtV（Vibrio cholerae protease,PrtV）对霍乱弧菌溶细胞毒素（Vibrio cholera crtolysin。VCC）引起人肠上皮细胞炎性反应的修饰作用。方法用VCC或PrtV处理后的VCC刺激人单层肠上皮T84细胞体外模型上层腔面,分析细胞受刺激后通透性和细胞活性改变以及细胞因子白细胞介素-8（interlukine-8．IL-8）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor—α,TNF-α）基因表达。结果VCC可引起极性的肠道T84细胞的炎性反应,表现为通透性增加和IL-8以及TNF—α基因表达增加。纯VCC蛋白在浓度为160ng／ml时引起肠上皮细胞炎性反应。而高浓度的VCC则导致肠上皮细胞损伤。VCC经PrtV处理后对肠上皮细胞炎性作用明显消失。螭论结果表明VCC在低浓度时引起肠道上皮的局部免疫防御反应,而高浓度的VCC则直接导致肠道上皮细胞损伤。此外,PrtV可以介导由VCC引起的肠上皮细胞炎性反应的修饰作用。     

小鼠骨髓源性内皮祖细胞的体外培养及标志物鉴定

［摘要］目的: 探讨小鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的体外培养、诱导分化及表面标志物的鉴别。方法： 收集ICR小鼠骨髓EPCs,Ficoll分离单核细胞,使用含有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基培养。分别在细胞培养5,10,15及20 d后检测细胞表面的内皮细胞标志物。结果： 培养5 d后细胞开始出现上皮细胞的形态,有伪足出现;培养10 d,细胞开始增殖,成圆形,出现梭形细胞;培养15 d,细胞出现较为典型的内皮细胞形态,铺路石状;培养20 d,细胞出现长梭形拉网状,即类似成熟内皮细胞形态。免疫荧光染色及流式定量检测结果显示,CD34在EPCs中的表达随培养时间延长有渐变减弱的趋势;血管内皮生长因子受体 2（VEGFR-2）在EPCs的表达随培养时间延长有渐变增强的趋势。结论： 骨髓EPCs在特定诱导条件下可分化出典型的成熟内皮细胞,取材方便,扩增能力较强。     

骨髓间充质干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞的研究

目的 探索大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化成内耳毛细胞前体细胞的过程,以期为耳蜗MSCs移植提供实验依据.方法 采用贴壁法提取SD大鼠MSCs,体外培养纯化.分别以EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA、EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3作为诱导条件,诱导MSCs分化.观察诱导组及对照组细胞形态的变化,并采用免疫细胞染色法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异性抗原myosinVI、Pax-2、nestin、p27kip1的表达.结果 EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA诱导组细胞呈短梭形样、方形样,未形成突触;myosin VI、Pax-2、nestin、p27kpi1均有不同程度阳性表达.EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3诱导组细胞变圆或变细长,逐渐伸出突触,部分形成网络状、大环状结构;nestin、p27kpi1均呈阳性表达.结论 大鼠MSCs在体外培养诱导分化后,可形成内耳毛细胞前体细胞和神经前体细胞.     

干细胞在急性肾损伤后肾脏修复中的作用

急性肾损伤是多种原闵引起的肾功能骤然下降的临床综合征,具有高发病率和高病死率的特点。急性肾损伤最主要的病理改变是肾小管上皮细胞坏死脱落阻塞管腔及基膜裸露。肾损伤修复依赖残存肾小管上皮细胞迁移、增殖、分化,覆盖暴露的肾小管基膜,从而恢复肾功能。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的克隆细胞,在肾损伤的修复中发挥重要作用。肾损伤动物模型的研究证实,坏死细胞的更替主要依赖成熟细胞分化,再次进入细胞周期,或依赖骨髓干细胞或肾脏器官特异干细胞的修复作用。文章就骨髓干细胞和肾脏成体干细胞在急性肾损伤后肾脏修复中的作用进行综述。     

普伐他汀对培养人内皮祖细胞药理作用的影响

目的观察普伐他汀对培养人内皮祖细胞（EPC）数量、增殖、迁移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,贴壁筛选法培养内皮祖细胞,培养7d后收集细胞并分别加入普伐他汀10μmol／L及100μmol／L,干预48h,免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定内皮祖细胞,分别观察内皮祖细胞的数量、增殖迁移黏附能力、细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA的表达以及培养液中NO的水平。结果普伐他汀组促进外周血内皮祖细胞扩增,并显著改善外周血内皮祖细胞的黏附、迁移、增殖以及eNOSmRNA表达和NO合成的能力。结论他汀类药物可增加培养人内皮祖细胞数量并改善其功能。     

高增殖潜能内皮祖细胞促进脐血造血祖细胞体外扩增

目的：研究脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的能力。方法：利用第3代的HPP—EPC联合细胞因子培养脐血造血干／祖细胞,分因子组、非接触培养组和接触培养组。体外培养脐血CD34＋细胞10d后,从细胞总数,CD34＋细胞数,各系造血集落形成细胞数等比较各组的扩增效率。结果：接触组细胞总数扩增倍数（44．6±8．7）倍和非接触组（39．5±7．3）倍均高于因子组（24．8±5．6）倍,P〈0．01。接触组CD34＋细胞数扩增倍数（8．8±2．1）倍高于因子组（2．9±0．6）倍和非接触培养组（3．3±0．6）倍,P〈0．01。接触组集落扩增倍数和非接触组均分别高于因子组,P〈0．05,且接触组各造血集落扩增数均分别高于非接触组,各P〈0．05。接触组扩增后CD34＋CD38＋细胞（10．8％±2．7％）明显高于因子组（4．1％±0．9％）和非接触培养组（3．8％±0．8％）,P〈0．01。结论：脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞能支持脐血CD34＋细胞体外扩增。     

脂质体介导Cyclin D1干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2全细胞蛋白质组表达的影响

目的探讨CyclinD1干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2细胞中CyclinD1mRNA的表达、对细胞周期和增殖以及蛋白质组表达变化的影响。方法构建CyclinD1干扰RNA的重组质粒pU6-CyclinD1-siRNA,并设立阴性对照空载体转染组和空白对照组。采用脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞,经G418筛选阳性转染细胞克隆,流式细胞术、MTT法检测其细胞周期、细胞生长曲线的改变;反转录PCR法及双向凝胶电泳．质谱技术比较转染前后CyclinD1mRNA的表达和蛋白质组表达的变化。结果（1）成功构建了CyclinD1干扰RNA的重组质粒pU6．CyclinD1．siRNA。并获得稳定转染组细胞HepG2-CyclinD1siRNA。（2）稳定转染组细胞与阴性对照组细胞和空白对照组相比,CyclinD1mRNA表达水平降低。细胞周期明显改变,从G1期到s期发生阻滞。（3）通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到稳定转染组低表达蛋白6个,经数据库搜索分别是锌指蛋白ZFP-36、角蛋白19、热休克蛋白伴侣素10、波形蛋白、肿瘤拒绝抗原gp96、未知蛋白。这些蛋白与细胞的增殖、细胞凋亡的信号转导调节、以及肿瘤的发生、发展等相关。结论CyclinD1干扰RNA可明显降低肝癌HepG2细胞CyclinD1mRNA的表达,亦可阻滞肝癌HepG2的细胞周期,抑制细胞增殖;CyclinDI干扰RNA干扰后差异表达的蛋白质涉及细胞的增殖、细胞凋亡的信号转导调节、以及肿瘤的发生、发展。