重组bcl-xL腺病毒对心肌细胞凋亡的影响

[目的]探讨转染人类抗凋亡基因bcl-xL能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性,评价它对心肌细胞的抗凋亡作用.[方法]体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立模拟心肌缺氧模型;将携带人类bcl-xL基因的重组腺病毒感染心肌细胞;免疫细胞化学染色法分析bcl-xL蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;荧光显微镜下观察心肌细胞表达绿色荧光蛋白,用Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化.[结果]转染rAd-bcl-xL/s的心肌细胞表达bcl-xL蛋白阳性单位(PU)(17.84±3.42)明显高于正常对照组(11.02±2.56)与rAd-bcl-xL/as转染组(8.53±2.25)(P＜0.01);缺氧诱导后心肌细胞凋亡指数为(45.67±8.47)%,而转染rAd-bcl-xL/s后的细胞凋亡指数减少至(9.42±2.48)%,有显著性差异(P＜0.01),未见典型的凋亡小体.[结论]腺病毒介导的bcl-xL基因能高效转染心肌细胞,并表达目的基因;外源性bcl-xL基因对体外培养的心肌细胞具有抗凋亡作用,能够提高心肌细胞对缺氧的耐受性,促进损伤心肌的恢复.     

野生型p53基因转移对心肌细胞生长的抑制作用

为了探讨野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的抑制作用及应用于高血压和肥厚型心肌病等疾病所致心肌肥厚的基因治疗可能性,本实验将野生型ｐ５３基因重组腺病毒转染体外培养的乳兔心肌细胞。应用生化染色方法,免疫组化法及聚合酶链反应技术,检测了野生型ｐ５３基因的转染效率及表达效果。采用ＭＴＴ方法及光镜技术进一步观察了野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的调节作用。结果显示,腺病毒载体能有效地将外源基因导入心肌细胞中并使     

野生型p53基因转移对心肌细胞形态的影响

目的：探讨腺病毒介导的野生型P53基因转移对心肌细胞形态的影响及P53基因用于心肌疾病基因治疗的可能性,方法：将腺病毒介导的野生型P53基因转入体外培养的乳兔心肌细胞,应用生化染色方法,Western blotting技术检测野生型P53型基因的转染效率及其表达效果,采用相差显微镜,透射电镜等实验方法观察心肌细胞的形态学改变。结果：重组腺病毒载体有效地将P53基因转入心肌细胞中并使其得以表达,转入的P53基因可以导致心肌细胞收缩,体积变小,胞浆浓缩,核固缩,染色质边集等改变,结论：野生型P53基因转移可以影响心肌细胞的形态,并能导致细胞凋亡。     

心肌细胞凋亡时基因调控的研究进展

心肌细胞凋亡是目前学术界十分关注的热点问题,它是心肌缺血缺氧、心肌缺血再灌注损伤、病毒性心肌炎、高血压、心肌梗死等众多心脏疾病的重要的病理生理机制,而心肌细胞的凋亡又受到基因的调控。因此从基因角度去研究、认识心肌细胞凋亡,将对心血管疾病的临床治疗和有效的预防提供很好的帮助。     

钙调磷酸酶Aα基因过表达在缺血/再灌注和肾上腺素能受体介导的心肌凋亡中的作用

目的研究腺病毒介导钙调磷酸酶Aα基因(AdCnAα)过表达对缺血/再灌注和肾上腺素能受体介导的心肌凋亡中的作用及p38MAPK的变化。方法体外培养乳鼠心肌细胞,分别给予Iso(10μmol/L) 缺氧24h/复氧4h(Iso H/R)及感染重组腺病毒(AdCnAα) Iso H/R处理,观察AdCnAα对Iso H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响。用DNALadder法及流式细胞仪DNA含量测定法(PI标记)检测心肌细胞凋亡,用RT-PCR法和Westernblot法分别检测CaNmRNA及蛋白表达,用Westernblot法检测p38、p-p38MAPK的变化。结果CnAα过表达组(AdCnAα Iso H/R)的心肌细胞凋亡率比Iso H/R组明显增加(14.247±0.525vs10.763±1.554,P<0.01),且均高于正常对照组;同时p-p38MAPK的表达也比正常对照组增加(2.42±0.19vs1.60±0.22,P<0.01);p38MAPK的表达在干预前后同正常对照组比较无差异性变化(P>0.05)。结论腺病毒介导的CnAα过表达可使Iso H/R共同作用诱导的心肌细胞凋亡率增加,p38MAPK可能参与了CaN促进Iso H/R诱导心肌细胞凋亡的信号转导过程。     

野生型p53基因转移对心肌细胞形态的影响

目的 :探讨腺病毒介导的野生型 p5 3基因转移对心肌细胞形态的影响及 p5 3基因用于心肌疾病基因治疗的可能性。方法 :将腺病毒介导的野生型 p5 3基因转入体外培养的乳兔心肌细胞 ,应用生化染色方法、Western blotting技术检测野生型 p5 3基因的转染效率及其表达效果 ,采用相差显微镜、透射电镜等实验方法观察心肌细胞的形态学改变。结果 :重组腺病毒载体有效地将 p5 3基因转入心肌细胞中并使其得以表达 ;转入的 p5 3基因可以导致心肌细胞收缩、体积变小、胞浆浓缩、核固缩、染色质边集等改变。结论 :野生型 p5 3基因转移可以影响心肌细胞的形态 ,并能导致细胞凋亡     

重组腺病毒转染兔心肌细胞的实验研究

目的:观察腺病毒载体转染兔心肌细胞的有效性和外源性基因表达的时相性.方法:用Adv5-CAG粘粒(对照组)或Adv5-CAG/LacZ质粒(治疗组)转染兔心肌,转染后第3、7、14、28天取被转染心肌组织行X-gal染色及β-半乳糖苷酶活性检测.结果:X-gal染色示,治疗组转染后第3、7、14、28天注射部位心肌均见蓝染,尤以第7、14天明显,而对照组所有心肌均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示治疗组转染后第3天心肌中即有β-半乳糖苷酶表达,第7、14天表达达高峰,28天表达量明显减少.结论:重组腺病毒载体可成功转染兔心肌细胞,外源性基因在兔心肌细胞中能有效地表达并能维持1个月左右.     

miR-1腺病毒载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定microRNA-1(miR-1)的腺病毒表达载体。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAdprecusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率。结果基因测序及酶切鉴定证实重组Adprecursor-miR-1腺病毒载体构建成功;腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平。结论利用同源重组的方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达水平。     

重组腺病毒载体携带凋亡素基因对肝癌细胞的作用

目的 探讨带有AFP启动子的重组腺病毒载体介导凋亡素基因对肝癌细胞的作用.方法 测定腺病毒AdAFPvp3滴度,并以MOI=100感染Hepal-6肝癌细胞(AFP ),HEK293细胞(AFP-),Lewis肺癌细胞(AFP-),24 h后Hoechst 33258染色观察凋亡形态学改变,RT-PCR检测vp3基因的表达.腺病毒AdAFPvp3以MOI=100感染hepal-6肝癌细胞,FCM检测肝癌细胞不同时段凋亡率.结果 腺病毒AdAFPvp3滴度为5×10(9)PFU/ml.Hoechst 33528染色显示甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞出现凋亡形态学改变,RT-PCR检测只有甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞表达vp3mRNA.FCM表明凋亡素基因能有效诱导肝癌细胞凋亡.结论 带有特异性甲胎蛋白启动子的重组腺病毒载体.介导凋亡素基因导入肝癌细胞后,对于能合成甲胎蛋白的肝癌细胞,具有特异性靶向性致凋亡作用.     

携带基因的冠状动脉支架和心血管再狭窄的基因治疗

通过在血管支架上固定化抗体并结合腺病毒载体实现了血管内部定位基因运载。可治疗经皮冠状动脉腔内形术及放置支架术后再狭窄疾病。     

AdCMVtk/GCV系统诱导肿瘤细胞死亡途径

目的 :探讨 Ad CMVtk/GCV系统诱导肿瘤细胞死亡的途径。方法 :采用台盼蓝染色检测坏死细胞数 ,吖啶橙荧光染色检测凋亡细胞数 ,同时观察凋亡细胞的形态学改变。结果 :Ad CMVtk/GCV系统诱导肺癌 ( Lewis)细胞死亡形式有两种 ,即坏死和凋亡 ,先出现凋亡 ,后引起坏死。结论 :HE染色及吖啶橙荧光染色可见典型的凋亡形态学改变。     

腺病毒介导RA538基因转移及其诱导肿瘤细胞凋亡的研究

ＲＡ５３８是从维甲酸诱导终末分化的人食管癌细胞系中分离出的一个与分化相关的基因。通过重组体腺病毒将ＲＡ５３８基因成功地转导到人肺腺癌细胞系（ＧＬＣ－８２）中,经Ｘ－ｇａｌ染色证实转导效率达１００％（ＭＯＩ为２５）,转录ＲＡ５３８基因后的ＧＬＣ－８２肿瘤细胞生长受到明显的抑制,抑制率为７７．２％。经流式细胞计数（ＦＣＭ）及ＴＵＮＥＬ检测证实ＲＡ５３８可诱导肿瘤细胞发生凋亡,凋亡率为５９．４％。利用Ｗ     

心肌特异性表达腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建心肌特异性表达的腺病毒载体,使外源基因在心肌细胞中特异性表达。方法：将心肌特异性肌凝蛋白轻链蛋白－２（ｍｌｃ－２ｖ）启动子克隆至腺病毒穿梭质粒,并将绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因克隆至此质粒中,同源重组含ＧＦＰ基因的缺陷型腺病毒（ＡｄｍｌｃＧＦＰ）,转染心肌细胞及非心肌细胞。结果：经ＲＴ－ＰＣＲ分析,转染的心肌细胞有ＧＦＰｍＲＮＡ的表达,而转染的非心肌细胞无ＧＦＰｍＲＮＡ的表达;荧光显微镜下观察,可见转染的心肌细胞表达ＧＦＰ,而转染的非心肌细胞不表达ＧＦＰ。结论：构建的心肌特异性表达腺病毒载体可使源基因在心肌细胞内特异性表达。     

腺病毒载体携带凋亡素基因对人胃癌细胞的致凋亡作用

目的 探讨带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的重组腺病毒载体介导的凋亡素(VP3)基因对人胃癌细胞的致凋亡作用.方法 在HEK293细胞中包装Ad-EGFP-VP3和Ad-EGFP两种腺病毒,大量扩增,并测定两种腺病毒滴度.以MOI=20感染人胃癌细胞,12,24,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;用Hoechst33258试剂盒染色,观察凋亡形态学改变.24 h后用RT-PCR检测VP3基因的表达.6,12,24,48,72 h后用FCM检测胃癌细胞的凋亡率.结果 Ad-EGFP-VP3滴度为2.4×108 pfu/ml,Ad-EGFP滴度为2.1×108pfu/ml.Hoechst33528染色显示Ad-EGFP-VP3感染的胃癌细胞出现凋亡形态学改变.RT-PCR检测仅有Ad-EGFP-VP3感染的胃癌细胞表达VP3基因的mRNA.FCM检测Ad-EGFP-VP3感染人胃癌细胞12 h后凋亡率达51.7%.结论带有EGFP标记的重组腺病毒载体介导VP3基因导入胃癌细胞后,能有效诱导胃癌细胞凋亡.     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

乳腺癌中抗凋亡基因bcl-2蛋白产物的表达及意义

bcl—2通过抑制细胞凋亡过程，从而导致肿瘤发生。为了检测bcl—2在乳腺癌中的表达情况及与临床病理的关系，应用枸椽酸—ABC——微波免疫组化技术．对87例福尔马林固定，石蜡包埋乳腺癌组织进行bcl—2癌基因蛋白表达的测定。结果显示：bcl—2蛋白在乳腺癌原发灶中的阳性表达率63．22％，其表达与ER、PR状况关系密切（均P＜0．001）；随着肿瘤病理学级别的升高，bcl—2蛋白表达率下降。bcl—2蛋白表达在区域淋巴结无转移组比淋巴结有转移组高（P＜0．001），bcl—2阳性表达率在术后生存期≥5年组比＜5年组高，且较少发生原位复发及脏器转移，差异具有显著性意义（P＜0．001）。提示；bcl—2蛋白参与乳腺癌的发生，并与好的预后因素相联系。     

抗凋亡基因Bcl—2在人卵巢癌表达的免疫组化检测

目的：了解Ｂｃｌ－２在卵巢癌中的表达情况，以探讨Ｂｃｌ－２在卵巢癌发生中的作用及其在临床诊断和预后方面的意义。方法：以ＳＡＢＣ免疫组化技术检测了５０例临床标本中Ｂｃｌ－２的表达状况。结果：１４／３０例卵巢癌呈阳性表达（４６．７％），全部属上皮性卵巢癌；４／１０例交界性卵巢肿瘤及２／１０例良性卵巢肿瘤有Ｂｃｌ－２表达。Ｂｃｌ－２的阳性率与卵巢肿瘤的良恶性及其临床分期未见显著相关性。结论：Ｂｃｌ－２在     

AdCMVtk／GCV系统诱导肿瘤细胞死亡途径

探讨ＡｄＣＭＶｔｋ／ＧＣＶ系统诱导肿瘤细胞死亡的途径。方法：Ｅ要用台盼蓝染色检测坏死细胞数，吖啶橙荧光染检测凋亡细胞数，同时观察凋亡细胞的形态学改变。结果：ＡｄＣＭＶｔｋ／ＧＣＶ系统诱导肺癌细胞死亡形式有两种，即坏死和凋亡，行出现凋亡，后引起坏死。结论ＨＥ染色及吖啶橙荧光染色可见黄型的凋亡形态学改变。     

腺病毒介导的p53和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：研究ｐ５３基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒ｐ５３和顺铂联合作用于人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９，对ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ａｄ－ＬａｃＺ进行复组腺病毒转导效率的检测，发现当ＭＯＩ为１００以上时，重组腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９细胞被传导，用ＲＴ－ＰＣＲ方法，在胆管癌ＱＢＣ３９细胞系中ｐ５３无表达。重组体腺病毒能介导外源基