DLC-1基因重组慢病毒表达载体的构建及其在结直肠癌SW480细胞中的表达

目的：构建携带肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-1,DLC-1）的重组慢病毒表达载体并实现DLC-1基因在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）SW480细胞中的过表达。方法：将DLC-1基因的靶序列与载体质粒pcDNA3.1（+）-GFP连接成重组质粒。重组质粒经双酶切法及基因测序验证构建正确后包装成慢病毒颗粒并计算病毒滴度。重组慢病毒感染SW480细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测感染率;real-time PCR及Western blot检测SW480细胞中DLC-1基因表达水平。结果：重组质粒构建正确。重组慢病毒滴度为1×109 TU/ml;对SW480细胞的感染率为90%;DLC-1 mRNA在重组慢病毒组细胞中过表达;重组慢病毒组DLC-1 蛋白的表达水平显著高于阴性对照组（P=0.000）;阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.902）。结论：成功构建了高滴度的DLC-1基因重组慢病毒,其携带的DLC-1基因能够在CRC SW480细胞中过表达,为后续研究DLC-1基因的表达在CRC的发生、发展中的作用奠定了实验基础。     

iASPP真核表达载体构建及其功能鉴定

目的构建P53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族的抑制成员iASPP的真核表达载体,并将其通过脂质体转染到结肠癌细胞株SW480及Lovo中,观察转染前后iASPP表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法将解放军第十六医院检验科经测序鉴定的pMD19-T-iASPP质粒亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,测序鉴定后用脂质体将重组质粒转染至结肠癌细胞株SW480及Lovo中,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测iASPP的表达以及用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化情况。结果重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,经酶切测序与GenBank上记录的人iASPP cDNA序列(gi 60457962)完全一致。经pcDNA3.1(+)-iASPP质粒转染的结肠癌细胞株SW480及Lovo的iASPP mRNA表达增高,细胞凋亡率下降。结论成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,并成功在结肠癌细胞株SW480及Lovo中获得了表达,细胞株的凋亡率下降,提示抑制iASPP高表达有可能成为恢复P53抑癌功能的新策略。     

Egr-1启动子调控hNIS基因的重组质粒构建及转染细胞株的建立

目的构建早期生长反应基因-1（Egr-1）启动子调控人钠碘转运体（hNIS）基因的重组质粒并稳定转染人宫颈癌细胞株Hela,评价Egr-1启动子对hNIS蛋白功能的辐射诱导作用。方法以Egr-1／pMRl8T为模板PCR扩增Egr-1启动子序列,亚克隆至真核表达载体FL％-hNIS／pcDNA3,构成重组质粒Egr-1-hNIS／pcDNA3,酶切电泳鉴定,通过FuGENEHD转染入Hela细胞,G418筛选抗性克隆,获取单克隆Hela—Egr-1-hNIS。分别采用流式细胞仪、RT．PCR检测Hela-Egr-1-hNIS细胞系中NIS基因和NIS蛋白的表达。动态摄取碘一125实验观察Hela—Egr-1-hNIS细胞和前期研究所得细胞株Hela—NIS（＋）给予不同剂量的x线辐照前后的摄碘功能。未转染的Hela细胞作为阴性对照组。结果成功构建重组质粒Egr-1．hNIS／pcDNA3,转染Hela细胞后获得了稳定表达细胞系Hela—Egr--一hNIS,流式细胞仪测得NIS表达效率为11．2％;RT—PCR检测到Hela—Egr-1-hNIS有NISmRNA的转录,而对照组无NIS蛋白表达。动态摄碘实验提示Hela—Egr-1-hNIS细胞摄碘能力比阴性对照Hela细胞提高了13倍;辐照后摄碘能力增强,在0～6Gy范围内与辐射剂量成正相关（r=0．960,P〈0．05）;而Hela—NIS（＋）组辐照后摄碘功能下降,与辐射剂量无相关性（r=-0．770,P〉0．05）。结论成功构建Egr-1启动子调控的稳定表达hNIS蛋白的Hela-Egr-1-hNIS细胞系,该细胞系具有较强的摄碘功能及辐射诱导作用,有望在体内治疗中获得更好的治疗效果。     

DLC-1过表达抑制结肠癌细胞生长及与Wnt/β-catenin信号通路的关系

目的：探讨在结肠癌细胞中抑癌基因DLC-1的作用及其与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法：以结肠癌SW480细胞系为实验对象,分为实验组（pcDNA3.1（+）-DLC-1组）,阴性对照组[pcDNA3.1（+）组]及空白对照组（SW480组）。用携带抑癌基因DLC-1的重组慢病毒表达载体转染各组,用MTT法检测各组细胞增殖活性,用流式细胞仪检测各组凋亡率,用real-time PCR及Western blot分别检测各组Wnt/β-catenin信号通路相关基因β-catenin、GSK-3β和c-myc的表达水平。结果：慢病毒介导DLC-1过表达使结肠癌细胞SW480的增殖受到抑制,增殖率为0.546,凋亡率明显增加,为42.422+3.413。转染DLC-1基因的结肠癌SW480细胞中β-catenin和c-myc的mRNA及蛋白表达水平较空白对照组及阴性对照组均明显下降,而GSK-3β的mRNA及蛋白表达水平较空白对照组及阴性对照组则明显上升,差异具有统计学意义（P均=0.000）。结论：慢病毒介导DLC-1过表达在结肠癌中有明显的抑癌作用,这种作用与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。DLC-1可能是Wnt/β-catenin信号通路的上游调节因子。     

Smad4真核表达质粒的构建及转染结肠癌细胞系SW480

目的 构建Smad4真核表达质粒并筛选稳定表达野生型Smad4基因的SW480结肠癌细胞系。方法 提取正常人体胎盘组织总RNA,PCR扩增人野生型 Smad4基因,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1(+)真核表达载体上,构建pcDNA3.1(+)-Smad4重组质粒,通过PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定,脂质体介导方法转染结肠癌细胞系SW480,G418筛选稳定表达株,RT-PCR方法检测其mRNA表达水平。结果 Smad4基因的PCR电泳结果显示在1 700bp左右有一明显亮带,连接载体后经鉴定证实为人Smad4-cDNA;稳定转染Smad4基因的SW480细胞RT-PCR结果提示Smad4的mRNA表达水平比对照细胞组明显升高。结论 成功扩增野生型Smad4基因,构建Smad4真核表达质粒,并筛选出Smad4基因稳定表达的SW480结肠癌细胞系。     

人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞介导放射性碘治疗的实验研究

目的：检测碘131（131I）对转染了人钠/碘转运体（hNIS）基因的人结肠癌细胞（SW480细胞）的杀伤作用。方法：将SW480细胞分为转染组、空白质粒转染组（空白质粒组）和空白对照组,行体外摄131I试验、高氯酸盐抑制实验,及AnnexinV-FITC/PI双染行流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：转染组与空白对照组及空白质粒组比较,摄131I能力均增高8倍;高氯酸盐可以有效地抑制转染组的摄131I能力;AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞仪检测结果显示,转染组凋亡指数高于空白对照组和空白质粒组。结论：131I对转染hNIS-SW480细胞具有显著杀伤效果。     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.     

Kiss-1与结肠癌SW480细胞增殖的关系

目的以结肠癌细胞SW480为模型,初步探讨Kiss-1基因过表达与结肠癌细胞增殖的关系。方法采用脂质体转染的方法将Kiss-1/pEGFP-N1重组质粒转染至SW480细胞,上调结肠癌细胞中Kiss-1的表达水平,经G418筛选出稳定表达株;根据细胞分为3组：阴性对照组（转染pEGFP-N1空载体）、实验组（转染pEGFPN1-Kiss1）及空白对照组（未转染）。Western blot检测转染后细胞中Kiss-1表达量的变化;采用CCK8试验分析Kiss-1对SW480细胞增殖的抑制效果。结果成功将pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒转染至SW480结肠癌细胞,western blot检测出阴性对照组和空白对照组中显示Kiss-1低表达,实验组Kiss-1表达量增加,CCK8试验表明实验组细胞增殖率明显低于对照组（P〈0.05）。结论 Kiss-1可抑制结肠癌细胞的增殖率。     

含hNIS报告基因的乏氧调控重组质粒的构建及其功能鉴定

目的构建乏氧应答启动子调控的人钠/碘共同转运体（hNIS）报告基因重组质粒,为实体瘤微环境乏氧的实时监测提供研究基础。方法合成乏氧反应元件（HRE）的核苷酸片段,克隆入pGL3-promoter,构建为pGL3-promoter-5×HRE载体。然后将扩增的hNIS基因插入pGL3-promoter-5×HRE载体中,构建为pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒并进行测序验证。以DMSO处理组作为对照,CoCl_2处理HEK293细胞模拟乏氧;将经验证的pShuttle-NIS质粒转染HEK293乏氧细胞,同时将构建的pcDNA3.1-HIF-1α质粒和pShuttle-NIS质粒按照3：1比例转染HEK293细胞,转染空质粒pcDNA3.1和pShuttle-NIS质粒组作为对照。通过qRT-PCR法检测hNIS基因表达的变化。并用高锝酸盐（~（99m）TcO_4~-）处理双质粒共转染的HEK293细胞,洗脱游离~（99m）TcO_4~-后通过γ计数器采集细胞放射性计数,检测所表达NIS蛋白的功能。结果克隆的基因产物与预期一致,序列无碱基的突变。共转染HIF-1α质粒组及转染pShuttle-NIS的CoCl_2处理组,其hNIS mRNA的表达量显著高于转染空质粒及DMSO处理组（均P〈0.01）。共转染HIF-1α质粒组细胞的~（99）TcO_4~-摄取率显著高于空质粒对照组（P〈0.01）。结论 pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒转染后能介导细胞摄取~（99m）TcO_4~-,为微环境细胞乏氧的核素显像提供实验依据。     

过表达Plk-1对gemcitabine诱导的胰腺癌细胞化疗敏感性的影响

目的观察Plk-1基因过表达对gemcitabine诱导胰腺癌细胞AsPC-1化疗敏感性的影响。方法①将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组,转染空载体设为对照组,无处理组设为空白组,转染24 h后,提取细胞总RNA和总蛋白,利用RT-PCR法及Western blot鉴定AsPC-1细胞内Plk-1基因和蛋白表达水平。②采用流式细胞术检测转染组细胞凋亡的改变。③不同浓度gemcitabine作用于转染细胞,MTT法测定转染48 h后细胞增殖能力。结果①测序结果表明成功的从AsPC-1细胞总RNA中扩增Plk-1基因。RT-PCR结果表明：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1 mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。Western blot结果显示：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1基因的蛋白表达水平为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。②在gemcitabine作用下,pcDNA3.1/Plk-1转染组细胞凋亡率明显低于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。③AsPC-1/Plk-1转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论胞浆过表达Plk-1活性分子可明显降低gemcitabine诱导的AsPC-1细胞凋亡,增强其对化疗药物的耐受性。     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体（PTHR）及其突变受体（DSEL）全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及
DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素（PTH）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方
法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1（+）,二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切,经T4
DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1（+）中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoR
Ⅰ与Not Ⅰ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL及空质粒pcDNA3.1
（+）分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重
组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）- DSEL
构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在
重组质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL
基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高
于空质粒pcDNA3.1（+）转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该
稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。
     

IDO基因稳定转染HepG2细胞系的建立

目的建立稳定转染IDO基因的HepG2细胞系,为进一步研究IDO基因在肝癌免疫逃逸中的作用奠定基础。方法应用脂质体将真核细胞表达质粒pcDNA3.1-IDO和空载质粒pcDNA3.1转染入HepG2细胞,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养,用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法验证获得的表达细胞株。结果经RT-PCR和Western blotting检测证实空质粒转染组和空白对照组HepG2细胞无IDO基因及蛋白的表达,而重组质粒组的HepG2细胞表达IDO基因和蛋白。结论 pcDNA3.1-IDO质粒体外稳定转染人肝癌细胞HepG2,可以有效地使IDO基因在RNA水平和蛋白水平均表达,成功建立了稳定转染基因IDO的HepG2细胞系,为进一步探讨该基因的功能奠定了一定基础。     

大鼠Smac基因的克隆及其在心肌细胞H9C2中的表达

目的：克隆大鼠促凋亡基因Smac,构建真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在心肌细胞中表达。方法：应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠肾组织中扩增到大鼠Smac基因的CDs片段,构建含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac并将此重组质粒、空载体pcDNA3.1⁺、pcDNA3.1⁺-EGFP通过脂质体介导转染大鼠心肌细胞H9C2,荧光显微镜、流式细胞术间接检测转染效率,RT-PCR法检测外源基因的表达。结果：经测序目的基因序列与GenBank（NM_001008292）公布的结果一致,所构建的重组质粒pcDNA3.1⁺-rSmac经PCR和酶切鉴定所释放的片段大小与预期结果相符。荧光显微镜和流式细胞术检测,细胞转染有效,转染效率达38.36%。转染重组载体pcDNA3.1⁺-rSmac 48 h后,H9C2细胞Smac的mRNA水平明显升高。其中,对照组Smac/β-actin为1.19,空载体组Smac/β-actin为1.31,二者之间差异无显著性（P>0.05）;转染pcDNA3.1⁺-rSmac组Smac/β-actin为1.67,与对照组比较差异具有显著性（P<0.01）。结论：克隆大鼠Smac基因成功,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在转染后的心肌细胞中表达,为研究Smac基因在心肌细胞凋亡过程中的调控作用奠定基础。     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

RNAi技术沉默PTHrP基因的表达诱导软骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对软骨肉瘤细胞增殖的影响.方法 本实验设置空白对照组、空质粒组和siPTHrP转染组,每组样本数均为6.空白对照组不做处理;分别将空质粒pSilencer3.1 H1 neo(空质粒组)和重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP(siPTHrP转染组)转染至SW1353软骨肉瘤细胞株,通过MTT法检测各组细胞活力并绘制细胞生长曲线,利用流式细胞技术测定细胞凋亡率,半定量RT-PCR和Western blotting法检测PTHrP基因在mRNA水平及蛋白水平表达上的变化.结果 siPTHrP转染组的细胞生长较空白对照组软骨肉瘤细胞明显缓慢;siPTHrP转染组细胞凋亡率明显升高;重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP能明显抑制软骨肉瘤细胞的PTHrP基因在mRNA转录水平和蛋白水平上的表达.结论 重组质粒pSilencer3.1H1 neo-siPTHrP可明显抑制软骨肉瘤细胞增殖及其内源基因PTHrP在mRNA转录水平和蛋白水平的表达,为PTHrP介导的软骨肉瘤基因沉默疗法提供了理论基础.     

艾地骨化醇通过抑制CYR61的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移

目的 探讨艾地骨化醇(eldecalcitol, ED-71)对骨肉瘤细胞增殖、转移和富含半胱氨酸蛋白61(CYR61)表达的影响。方法 首先，使用Lipofectamine 2000将CYR61过表达重组pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-CYR61组)及阴性对照pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-NC组)转染到人骨肉瘤细胞系(U2OS)中，通过RT-PCR和Western blot验证转染效率。然后，将U2OS细胞分为对照组、ED-71组、ED-71+pcDNA3.1-NC组和ED-71+pcDNA3.1-CYR61组，对照组和ED-71组细胞未进行转染，ED-71+pcDNA3.1-NC组细胞转染pcDNA3.1-NC,ED-71+pcDNA3.1-CYR61组细胞转染pcDNA3.1-CYR61。转染后，对照组细胞不做药物处理，其余3组细胞用含有5 nmol/L艾地骨化醇的1640培养基培养24 h。CCK-8法和集落形成实验测定U2OS细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭，RT-PCR检测细胞中CYR61 mRNA水平，We...     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

DHRS7对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及其在乳腺癌组织中的表达

［摘 要］目的：探究 DHRS7基因过表达和DHRS7特异性短发夹RNA(shRNA)重组质粒对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及DHRS7与乳腺癌浸润癌的关系,阐明DHRS7在乳腺癌发生、发展中的作用。方法：利用RT-PCR技术将DHRS7基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1( + )质粒中,构建pcDNA3.1-DHRS7重组真核表达质粒。实验分为pcDNA3.1-DHRS7组、阴性对照组(pcDNA3.1组)、空白对照组和DHRS7-shRNA-pGenesil组,用Fugene HD转染试剂将各种质粒转染MCF-7细胞,采用RT-PCR和Western blotting法检测各组MCF-7细胞中DHRS7的表达情况,流式细胞术分析细胞周期变化,免疫组织化学SP法检测乳腺原位癌和乳腺浸润癌组织中DHRS7蛋白的表达情况。结果：成功构建pcDNA3.1-DHRS7重组表达质粒。PCR和Western blotting结果显示,pcRNA-DHRS7组蛋白的表达量高于空白对照组（P<0.05）,DHRS7-shRNA-pGenesil组蛋白的表达量低于空白对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术显示,DHRS7表达上调使MCF-7细胞S期细胞增多（P<0.05）,DHRS7的表达下调使处于G2期的细胞增多（P<0.05）。免疫组织化学染色显示,DHRS7蛋白在原位癌中高表达,阳性表达率为100%（37/37）;在乳腺浸润癌的表达明显降低,阳性率为18.9%（7/37）,两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：DHRS7基因参与了MCF-7细胞细胞周期的调控过程,可以抑制细胞增殖,DHRS7蛋白的表达丢失可能促进乳腺癌浸润。