鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因在大肠杆菌中的表达

目的　构建柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。　方法　将本室构建的pMD Mz5 7克隆质粒酶切回收目的片段定向亚克隆到pET 2 8b( )载体上 ,构建成原核表达载体pET 2 8b Mz5 7,酶切鉴定正确后 ,在EscherichiacoliBL2 1(DE3 )中用IPTG诱导表达 ,并经SDS PAGE及Westernblotting鉴定。　结果　成功构建了目的抗原基因的原核重组表达质粒pET 2 8b Mz5 7,IPTG诱导表达该融合蛋白 ,SDS PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 3 7ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符 ,最佳反应条件为 1mol LIPTG诱导 4h后表达量最高。薄层扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的 18% ,Westernblotting结果显示 ,表达产物可被抗柔嫩艾美尔球虫的多克隆抗体识别 ,说明该融合蛋白具有很好的反应原性。　结论　在原核细胞融合表达Mz5 7成功 ,为鸡球虫病重组苗的研究奠定了基础。     

不同地理株杂交培育的柔嫩艾美球虫及其免疫保护率

目的　培育 3个不同地理株柔嫩艾美球虫 (Eimeriatenella)的杂交株 ,以探讨研制球虫疫苗的可能性。　方法　通过免疫试验 ,从 5个不同地理株中选择 3株作为杂交亲本株 ,对此 3株分别进行两次杂交 ,获得的后代混合卵囊经单卵囊分离、扩增 ,分别提取卵囊DNA ,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)进行分析 ( 3 0条引物 ) ,分离、培育出两代杂交株。再进行免疫试验 ,比较杂交株与亲本株的免疫保护性。　结果　选择了免疫原性较好、免疫保护率较高的广州株、保定株、长春株作为杂交亲本 ,分别进行保定株×长春株、广州株×F1株两次杂交 ,获得的后代卵囊 ,提取卵囊DNA ,RAPD分析后 ,得到了保定株×长春株的杂交株F1(F1Z7)和广州株×F1株的杂交株F2 (F2Z3 )。免疫试验结果 ,杂交株F1与F2的免疫保护率分别为 80 %和 84% ;亲本株广州株为 77% ,保定株为 69% ,长春株为 63 %。　结论　分离、培育出了F1、F2两代杂交虫株。其免疫保护率均高于各亲本株 ,提示杂交株获得了亲本株的部分保护性 ,其免疫的雏鸡对各虫株的攻击均有好的保护力。尤其是F2株 ,免疫保护率平均达到 84%。     

微小隐孢子虫cDNA文库的构建及P23、CP15/60基因的克隆

目的　微小隐孢子虫地方株cDNA文库构建及P2 3、CP15 60基因的克隆。　方法　提取微小隐孢子虫总RNA、mRNA ,逆转录合成cDNA。将cDNA与 pUC18DNA连接 ,导入DH5α宿主细胞中生成cDNA文库。根据文献分别设计并合成两对PCR引物 ,从上述文库中筛选保护性基因 ,对PCR产物克隆、测序。　结果　文库容量为 1.9× 10 6个重组子 ,文库中cDNA插入片段大小介于 0 .4× 10 3～ 6.5× 10 3bp。从该文库中克隆出编码 2 3kDa、15 60kDa子孢子表面蛋白的核苷酸序列。　结论　成功地用 pUC18质粒载体构建了C .parvumcDNA文库。     

弓形虫亲环蛋白亚单位疫苗的免疫保护性研究

目的研究弓形虫亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)亚单位疫苗的免疫保护性。方法 30只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、佐剂组和PBS对照组,分别肌注pET-28a-TgCyP重组蛋白100μg/只、佐剂100 ul/只和PBS 100 ul/只,共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠处死,取脾脏,检测CD4+、CD8+及细胞因子。同时,采用阿尔玛蓝细胞增殖与细胞毒性检测试剂测定小鼠脾淋巴细胞的增殖应答。其余小鼠腹腔攻击感染Rh株弓形虫速殖子500个,观察其存活情况。结果 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠的CD4+T细胞(62.59±4.17)%、CD8+T细胞(8.53±0.46)%与PBS及佐剂对照组比较显著增殖(P<0.01),其脾细胞培养液白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)显著升高,小鼠脾淋巴细胞增殖应答显著增强(P<0.01)。弓形虫攻击感染216 h后,实验组小鼠免疫保护率为33.3%,佐剂对照组及PBS对照组小鼠均全部死亡。结论 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗具有较强的免疫原性,能...     

犬蠕形螨病病理组织学观察

目的　研究蠕形螨病病犬皮肤、淋巴结及内脏中蠕形螨的寄生情况及病理组织学变化。　方法　解剖蠕形螨病病犬 ,分别对皮肤、腮腺淋巴结、下颌淋巴结等 13个部位淋巴结以及肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、心脏等分别用 5 %NaOH消化法和病理组织切片法进行检查 ,并测量虫体大小。　结果　除了在重症蠕形螨病病犬的皮肤组织外 ,在部分浅表淋巴结中也检查到了蠕形螨虫体和虫卵 ,而内脏中除了肝脏、肺脏外 ,其他脏器未查到蠕形螨虫体和虫卵。皮肤病变主要发生于毛囊和真皮 ,破坏的毛囊周围组织见以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润病变 ,并有程度不同的炎性细胞浸润和结缔组织增生 ,病变淋巴结均呈现不同程度的增生性淋巴结炎、出血性淋巴结炎和卡他性淋巴结炎。而各脏器切片均未发现有明显病变。经对皮肤和淋巴结内虫体进行测量 ,淋巴结内成虫明显比皮肤内的小 (P <0 .0 1)。而若虫大小及虫卵大小则差异不明显 (P >0 .0 5 )。　结论　蠕形螨不仅寄生于犬皮肤 ,还能在许多浅表淋巴结寄生 ,并能造成明显病变。     

旋毛虫抗小鼠体内SP2/0肿瘤作用的研究

目的观察旋毛虫感染对BAlB/c小鼠体内SP2/0瘤细胞生长的抑制作用。方法用不同剂量、不同方法致弱的旋毛虫感染BALB/c小鼠,在不同时间接种SP2/0细胞,于荷瘤后20 d解剖小鼠,测定小鼠体内肿瘤的体积、重量和无瘤生长小鼠比率,检测T淋巴细胞亚群。结果1)未致弱组、紫外线致弱组和60Co致弱组小鼠肿瘤体积和重量均显著低于对照组(P<0.01),CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05);无瘤生长小鼠比率显著高于对照组;2)接种750条、500条和250条旋毛虫组肿瘤体积和重量均显著低于对照组(P<0.01),CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05),无瘤生长小鼠比率显著高于对照组;3)接种3 d1、1 d和21 d后荷瘤组的肿瘤体积和重量均显著低于对照组(P<0.01),CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05),无瘤生长小鼠比率显著高于对照组。结论未致弱的旋毛虫和经不同方法致弱的旋毛虫对BALB/c小鼠体内的SP2/0骨髓瘤细胞的生长均有抑制作用,接种剂量增加,抑瘤效果越明显,但对实验动物的机体损伤也加重。接种11 d后荷瘤组的抑瘤效果好于接种3 d后荷瘤组和21d后荷瘤组。     

二维牵引治疗膝关节骨关节炎内外翻畸形的临床研究

目的寻求新的牵引方法治疗膝关节骨关节炎患者的膝关节内外翻畸形。方法将100例患者随机分为治疗组和对照组各50例，2组均采用手法、中药熏治、关节内注射医用透明质酸钠凝胶和功能锻炼。在此基础上对照组采用单向轴向牵引，治疗组采用二维牵引。评估2组治疗后的临床疗效，并对治疗前、治疗3周、治疗6周后的疼痛和综合功能评分以及胫股角的变化进行比较。结果治疗组优良率8l％，对照组优良率59％，2组比较有显著性差异（P〈0．05）；2组疼痛评分和综合功能评分在治疗3周、6周后与治疗前相比均有显著性差异（P均〈0．05），且治疗组优于对照组；6周后治疗组的胫股角较治疗前有明显减小，且优于对照组（P〈0．05）。结论二维牵引对于膝关节骨关节炎内外翻畸形具有良好的治疗效果，值得推广和使用。     

KOZAK序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞CCNL1基因表达的影响

目的：探讨KOZAK序列对细胞周期调节蛋白1（CCNL1）基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达的影响。方法：构建pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K（含有KOZAK序列）的真核重组表达质粒,采用Fugene HD转染试剂将重组表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K重组质粒在MDA-MB-231细胞中表达的差异。结果：在MDA-MB-231细胞中质粒pcDNA3.1-CCNL1-K比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量要高;而质粒pcDNA3.1-CCNL1比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量也高。结论：在MDA-MB-231细胞中,质粒pcDNA3.1-CCNL1-K较pcDNA3.1-CCNL1的mRNA和蛋白表达水平均存在差异,KOZAK序列能够提高CCNL1基因在MDA-MB-231细胞中的表达。     

KOZAK序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞CCNL1基因表达的影响

目的:探讨KOZAK序列对细胞周期调节蛋白1(CCNL1)基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达的影响。方法:构建pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K(含有KOZAK序列)的真核重组表达质粒,采用Fugene HD转染试剂将重组表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K重组质粒在MDA-MB-231细胞中表达的差异。结果:在MDA-MB-231细胞中质粒pcDNA3.1-CCNL1-K比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量要高;而质粒pcDNA3.1-CCNL1比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量也高。结论:在MDA-MB-231细胞中,质粒pcDNA3.1-CCNL1-K较pcDNA3.1-CCNL1的mRNA和蛋白表达水平均存在差异,KOZAK序列能够提高CCNL1基因在MDA-MB-231细胞中的表达。     

热射病小鼠早期中枢神经炎症和外周炎症的变化

目的 探讨热射病小鼠早期(0～24 h)中枢神经炎症和外周炎症的变化及其相关性.方法 70只BALB/c雄性小鼠按随机数字表法分为正常对照组和热射病后各时相(0、1、6、12、24 h)观察组.应用环境模拟舱建立热射病小鼠模型.观察记录各组小鼠生存率、直肠温度变化和体质量变化,Real-time PCR检测大脑皮层和海马炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,ELISA测定外周血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌情况,鲎试剂动态浊度法检测血清中内毒素浓度.结果 热暴露后小鼠直肠温度超过42℃,1～2h出现低温期,24 h后小鼠存活率为78.57％,成功制备热射病小鼠模型;大脑皮层及海马在热暴露后1h炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的基因表达显著增加并达到最高峰值(P＜0.01),6h后逐渐降低但仍明显高于正常对照组(P＜0.01),24 h后基本恢复至正常对照组水平(P＞0.05);外周血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6在1h后含量显著增加(P＜0.01),之后缓慢下降,到24 h后仍高于正常对照组(P＜0.01);血清内毒素在热暴露即刻(0 h)开始明显升高,6h后达到峰值,至24 h仍明显高于正常对照组(P＜0.01).结论 热射病小鼠在热暴露12 h内中枢神经系统出现一过性炎症反应,而外周炎症反应持续至24 h之后,提示热射病小鼠早期中枢神经炎症反应与外周炎症反应可能是相互独立发生.