辛伐他汀抑制乙醇诱导骨髓基质细胞成脂分化的实验研究初步报告

目的观察辛伐他汀抑制乙醇诱导骨髓基质细胞成脂分化的作用，探讨辛伐他汀治疗酒精性骨坏死的可能性。方法分离培养SD大白鼠骨髓基质细胞，随机分为三组：模型组：实验周期的前半程以含终浓度0．09mol／L乙醇的培养液培养，后半程停用乙醇；实验组：实验周期的前半程以含终浓度0．09mol／L乙醇的培养液培养，后半程停用乙醇，改以含终浓度1×10^-7mol／L辛伐他汀的培养液培养；对照组：全程以不加乙醇和辛伐他汀的培养液培养。镜下观察细胞变化，测定细胞培养液中骨钙素含量、细胞内ALP活性及甘油三酯含量。结果按上述处理细胞并培养14d后，实验组中细胞内碱性磷酸酶活性、培养液中骨钙素含量均高于模型组（P〈0．05），与对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。上述处理细胞并培养21d后，实验组中脂肪细胞数量、细胞内甘油三酯含量均低于模型组（P〈0．05），与对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论可以认为辛伐他汀能抑制乙醇诱导骨髓基质细胞分化为脂肪细胞，促进成骨分化，可能有治疗酒精性骨坏死的作用。     

抗伤寒霜对寒冷条件下大鼠生化指标影响的实验研究

目的：通过预防性用药，观察大鼠寒冷条件下生化指标的变化，评价抗寒霜对提高耐寒能力的作用，为预防冻伤提供有效的药物及给药途径。方法：制备大鼠左足冻伤模型。实验分为三组，对照组为冻伤模型组，实验1组为抗寒Ⅰ号霜组，实验2组为抗寒Ⅱ号霜组，检测生化指标22项。结果：对照组转氨酶(ALT、AST)、尿素氮(BUN)均显著增高，血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK）、羟丁酸脱氢酶(HBD)、胆碱脂酶(CHE)活性增强，与两个实验组相比较有显著性差异。结论：抗寒霜对寒冷条件下大鼠的重要器官有一定的保护作用，从而为进一步深入研究提供了可靠依据。     

血糖安的细胞毒理学实验研究

目的 探讨血糖安(XTA)对心肌细胞的毒性作用及其机制。方法 采用循环灌流的方法急性分离成年脉鼠心肌细胞，使其在血糖安浓度为1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1nmol/L作用后，分别检测30、60、120、180min4个时相心肌细胞保存液中LDH、CK含量，心肌细胞蛋白含量和Na —K ATP酶活性；检测心肌细胞凋亡率和细胞活力；电镜下观察死亡和凋亡细胞的形态学变化。结果 在血糖安100umol/L和1mmol/L两个组的各时相保存液中，LDH、CK以及心肌细胞中蛋白含量明显增加；心肌细胞中Na —K ATP酶活性和细胞活力明显降低，与对照组相比有显著性差异(P＜0．01)。结论 在血糖安浓度高于100umol/L且作用时间在30min以上时，豚鼠心肌细胞开始出现损害。     

桃红四物汤抗急性心肌缺血的实验研究

目的:观察桃红四物汤对急性心肌缺血犬缺血心肌的保护作用。方法:采用结扎冠状动脉左前降支的方法复制急性心肌缺血模型,实验结束后检测肌酸磷酸激酶(CPK),乳酸脱氢酶(LDH),观察心肌组织病理学变化。结果:心肌缺血组CPK、LDH含量均明显升高,与对照组比较有显著差异,心肌细胞坏死增多。挑红四物汤组CPK及LDH含量均低于缺血组,与对照组比较无显著差异,心肌坏死程度较低。结论:桃红四物汤可降低CPK、LDH水平,减少心肌细胞坏死,对缺血心肌有保护作用。     

离体兔心心肌保护的实验方法

本实验应用循环式非搏动灌注装置连接的离体兔心模型。了心肌在体温下缺血期间和再灌注期间心肌酶的变化及应用血液灌注液对心肌保护的效果。实验分二组，A组应用临床使用的心脏停搏液，B组在上述停搏液中加入1：1血流，心脏均在20度下缺血2小时后，应用37度释稀的自体氧合血液再灌注60分钟，本实验用Multistat III型全自动生化分析仪检测血浆中LDH，CPK和SGOT的活性，并且对心肌含水量，冠状血管阻力和冠脉血流量变化进行观察，结果发现，缺血前AB两组血浆中LDH，CPK和SGOT无明显差别（P＞0．05），随着缺血后再灌注时间延长，AB两组血浆中酶均不断上升，说明发生心肌再灌注损伤，但两组相比，B组心肌所释放的LDH，CPK和SGOT较A组低，冠状血管阻力降低，冠状血流量增大，说明血流灌注液比晶体液的保护效果明显，可能是血液在心肌缺血状态提供氧基质，保证细胞代谢和维持内环境的稳定，减轻心肌细胞的结构损伤和功能恢复。     

金路捷对大鼠脑神经细胞损伤的保护作用

目的建立体外培养大鼠脑神经细胞损伤模型,测定损伤前后不同时间LDH的水平,研究金路捷对脑皮质神经元的保护作用机制。方法原代培养新生Wistar大鼠的脑皮质神经细胞,建立体外脑神经损伤模型,通过测定神经细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)的含量变化观察模型对神经细胞的损伤作用。结果损伤组与对照组神经细胞损伤后LDH值比较差异均有显著性(P<0.05),证明损伤模型确实有效;本实验表明治疗组神经元LDH的水平与损伤组比较有差异(P<0.05),证明金路捷能够起神经元保护作用。结论损伤模型损伤前后各时间点LDH活力损伤组与对照组比较,表明本实验应用的损伤模型确实使细胞损伤。     

本科线粒体活体染色与观察实验效果控制技术的探讨

“线粒体活体染色与观察”实验，是形态学类实验中操作和观察细胞显微结构的重要实验内容，由于线粒体是形态相对典型、观察比较容易的细胞器，所以这个实验一直以来都是本科生细胞生物学实验中关于细胞器的标本片制作与观察的代表性实验。     

生长激素对大鼠心肌、骨骼肌形态学及激素水平的影响

目的：研究生长激素（GH）对大鼠心肌、骨骼肌形态学和体内GH水平的影响。 方法：给大鼠连续15 d皮下注射GH,并设安慰剂对照组。体内GH水平采用放射免疫方法测定;测定实验后大鼠体重、重要器官/体重比值;镜下观察心肌和骨骼肌细胞形态。 结果：GH组体内GH水平明显升高;大鼠体重较正常对照组明显增加;但器官/体重比值二组差异无显著性;光镜下GH组心肌、骨骼肌纤维肥大,细胞核增多,但无毛细血管增生和炎性细胞浸润。结论：GH可使心肌细胞、骨骼肌细胞肥大而不是间质组织增生。     

二十五味珍珠胶囊长期毒性实验研究

对二十五味珍珠胶囊长期给药的毒性进行实验研究。结果表明，按临床给2药量的70倍和20倍连续60天给大鼠灌胃给药，两个给药组动物外观体征，一般活动未见异常，体重变化，饲料消耗量与对照组比较无明显差异；两个给药组动物血液学指标，血液生化学指标与对照组比较差异无显著意义；心，肝，脾，肺，肾，肾上腺等重要脏器病理组织学检查未见药物引起的异常改变。停药2周后，各给药组动物上述观察指标与对照组比较，无明显差异。实验结果提示该药按临床规定剂量使用具有一定的安全性。     

无血清条件下紫外线诱导表皮细胞凋亡的实验研究

目的：观察紫外线照射诱导新生大白鼠表面细胞凋亡。方法：用不同剂量的紫外线照射培养条件下和活体状态下表皮细胞，采用Tunel法检测表皮细胞凋亡，流式细胞仪观察表皮细胞P53、Bcl-2、CD95表达。结果：传代培养12－24h ,et 1500J/m^2紫外线照射，照射后继续培养24－48h表皮细胞凋亡率达高峰。紫外线照射后的表皮细胞P53表达升高。相同剂量紫外线照射，活体状态下表皮细胞凋亡率低于培养表皮细胞。结论：表皮细胞凋亡与P53表达升高相关，活体上的表皮细胞能较强抵搞紫外线诱导的凋亡作用。     

人骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的实验研究

目的创伤等因素造成的关节软骨的损伤和退变是骨科常见和难以解决的问题之一。干细胞尤其是骨髓来源干细胞的研究促进了组织工程在骨关节领域的发展。文中研究体外单层培养条件下,成人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）经诱导定向分化软骨细胞可行性。方法用全血贴壁法分离培养BMSC,并传代扩增后,用单层培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养21d,以常规培养液培养的BMSC作为阴性对照。光镜下观察诱导细胞形态学的改变,苏木素-伊红（HE）染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化等方法检测诱导细胞的分泌功能。结果BMSC经21d的单层诱导培养后,细胞形态由长梭形向多角形类圆形转变,细胞爬片甲苯胺蓝染色呈明显异染,Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学检测阳性,对照组阴性。结论成人BMSC在单层培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

大鼠骨髓主要细胞成分的分离获取及其免疫调节作用

目的:建立分离获取大鼠骨髓主要细胞成分的方法,了解其免疫调节作用,为骨髓主要细胞成分输注诱导同种异基因移植物免疫耐受奠定基础。方法:采用密度梯度离心法、红细胞裂解法及细胞培养等方法,分离纯化供体大鼠骨髓细胞(donor bone marrow cells,DBMC)、骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)、不成熟树突细胞(immature dendritic cells,imDC),经光镜、电镜形态学、FCM测定imDC表面OX-62、MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达、MSC表面CD80-CD86-和CD29表达等细胞表面标志的表型鉴定后,用MTT法检测DBMC、MSC和imDC对供受体混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocytesreaction,MLR)的免疫调节作用。结果:分离获取大鼠骨髓主要细胞成分纯度可达85%-90%,活力>95%,均经光镜、电镜形态学、FCM等表型鉴定合格,其中,imDC表面OX-62、MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达量分别是90.5%±16.4%、89.5%±6.2%、32.5%±9.2%和27.6%±8.3%;MSC表面CD80-C...     

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法：选取2月龄约2．5kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果：全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论：全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

克隆化的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性的研究

目的:分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立克隆化扩增的细胞系并初步鉴定其分化特性和细胞的分子标记.方法:利用间充质干细胞贴壁生长的特性,显微镜下挑取原代单个成纤维样生长单位中的细胞,逐步扩大培养,最终得到克隆化扩增的hMSCs.选择有利于其生长的血清,低密度培养,传70%～80%生长汇合时传代保种.RT-PCR检测其Oct-4、SDF1、CD49a、CK19、c-met基因的表达;流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD90、HLA-1和HLADR;体外向骨、软骨、脂肪细胞方向诱导分化鉴定其分化潜能.结果:建立了人骨髓间充质干细胞系并在体外实现了克隆化扩增,该细胞系在体外连续培养达60个细胞倍增时间仍保持多向分化的潜能.细胞不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR,但表达Oct-4、SDF-1、CD49a、CK19、c-met、CD44、CD29、CD90、HLA-1.体外能诱导出骨、软骨、脂肪细胞.结论:得到了一个可稳定传代的克隆化扩增的人骨髓间充质干细胞系,该细胞系在体外可以分化为骨、软骨、脂肪细胞,并表达Oct-4、CK19和c-met.     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）在特定培养条件下向软骨细胞定向分化的情况。方法密度梯度离心法分离兔BMSCs，在体外培养扩增后用含有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP)-2的条件培养液诱导其在体外单层培养模式下向软骨细胞分化。采用甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫组织化学染色、阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量检测BMSCs分化情况。统计学分析比较第2、4、7代（P₂、P₄、P₇）BMSCs诱导后增殖能力及向软骨细胞分化能力的变化。结果定向诱导后BMSCs表现出软骨细胞的特性。P₂、P₄间的细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）；P₇与P₂、P₄相比，细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论BMP-2能诱导兔BMSCs在体外单层培养模式下向软骨细胞分化；细胞传代对BMSCs向软骨细胞分化有重要影响。     

人骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞过程中免疫原性改变的实验研究

目的 探讨人骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）诱导分化成软骨细胞过程中协同刺激分子的表达及其对细胞免疫原性改变的影响。方法 用密度梯度离心法分离骨髓,体外培养BMSCs,经形态学观察、流式细胞仪鉴定后诱导成软骨样细胞,用流式检测细胞表面协同刺激分子的表达情况;将未分化的BMSCs及诱导后的成软骨样细胞分别与T细胞共培养,采用3H-TdR法检测T细胞的增殖情况。结果 人BMSCs不表达或低表达协同刺激分子CD28、CD80、CD83、CD86,抑制T细胞增殖;而诱导后的成软骨细胞上调表达CD28、CD80、CD83、CD86,并促进T细胞增殖。结论 人BMSCs对T细胞增殖有抑制作用;而诱导后的成软骨细胞免疫原性增强,促进T细胞增殖。     

Observation of the biological behavior of in vitro cultured immortalized chondrocytes induced by SV40LTAg gene transfection]

OBJECTIVE: To investigate the biological characteristics of immortalized chondrocytes cultured in vitro. METHODS: Primary chondrocytes were immortalized with SV40LTAg gene transfection and grown in monolayer culture. The biological characteristics of the cells were defined in terms of cell morphology and proliferative capacity observed under inverted microscope. GAG synthesis was assessed with toluidine blue and safranine O staining and type-II collagen levels by immunohistochemistry. RESULTS: After 50 passages, the immortalized chondrocytes appeared polygonal or triangular with still vigorous proliferative capacity in monolayer culture and positivity for GAG and collagen type II as characteristic of chondrocytes. CONCLUSION: The immortalized chondrocytes cultured in vitro can maintain their phenotype in a long term.     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的: 探讨内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)分离培养鉴定方法及其生物学特性。方法： 采用梯密度离心法结合差速贴壁法分离获取大鼠骨髓单核细胞,培养于EGM 2 MV SingleQuots内皮细胞培养液中,分别取48 h内贴壁细胞(早期EPCs)和48 h后贴壁细胞(晚期EPCs),在倒置显微镜下观察细胞形态,应用流式细胞术鉴定EPCs表面抗原标志CD34,CD133和血管内皮生长因子受体 2（VEGFR 2）,激光共聚焦检测EPCs吞噬功能,透射电镜观察EPCs内部超微结构。结果： 单核细胞接种后呈小圆形,早期EPCs呈长梭形,晚期以纺锤形为主,培养7 d后有明显干细胞集落;增殖至第6代以后,形态开始逐渐接近于内皮细胞,并出现管腔样结构。内皮祖细胞表面标志CD34,CD133和VEGFR 2均呈阳性表达,能吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白并结合FITC标记的凝集素 1。透射电镜可观察到内皮细胞特征性细胞器Weible Palade小体。结论： 梯密度离心法结合差速贴壁法能够成功地从骨髓中分离、纯化、培养出内皮祖细胞,其增殖能力强,数量充足,生物学特性稳定。