正常人关节软骨细胞的培养及冻存复苏的影响

目的观察正常人关节软骨细胞的体外培养及冻存后再复苏对人体关节软骨细胞活性所产生的影响。方法在无菌条件下取因创伤所致离断且无再植条件残肢的关节软骨组织,采用Ⅱ型胶原酶一次消化的方法获取原代软骨细胞后进行体外培养,并经10%DMSO冻存液冻存及常规复苏,过程中均用倒置显微镜定期观察软骨细胞的形态生长变化以及复苏后细胞的存活率。结果常规消化传代后的第2～4代间贴壁时间无明显差别,但较原代明显变短,生长速度加快,在形态上仍以三角或多角形为主,传代在5代以内的软骨细胞仍能保持正常的组织学形态,且复苏后软骨细胞的存活率能达95%。结论原代培养获得的正常人体关节软骨细胞在5代以内者可以较好地保留软骨细胞的特性和活性。     

不同冻存条件下HepG_2细胞存活率的比较

目的探讨不同冻存条件下对HepG_2细胞存活率的影响,以提高复苏细胞的存活率。方法取对数生长期HepG_2细胞,分别配制传统冻存液A、改良冻存液B,采用方法1(人工梯度降温法)和方法2(程序降温盒法)两种冻存方法进行冻存,在冻存1个月、6个月、12个月后分别对细胞进行复苏,检测细胞的存活率并观察复苏细胞的生长状态。结果冻存1个月后复苏,冻存液A、B两组细胞的存活率差异无统计学意义(P>0.05),冻存6个月、12个月后复苏,冻存液A组细胞存活率显著低于B组(P<0.01);B组细胞复苏的生长状态及增殖速度都明显优于A组,两组细胞的数量差异有统计学意义(P<0.05);以方法1、2冻存的细胞,在冻存1个月、6个月、12个月后复苏细胞,方法2细胞的存活率均显著高于方法1(P<0.01)。结论采用含高浓度血清的冻存液及缓慢降温有利于提高细胞复苏的存活率。     

成年大鼠神经干细胞的冷冻复苏及生物学特性观察

目的 建立成年大鼠神经干细胞冷冻复苏方法，观察冻存复苏后神经干细胞的活力及生物学特性。方法 采用10％BSA 8％DMSO做冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和免疫细胞化学方法观察冻存复苏后细胞的活力、形态、分化能力及特异性抗原表达。结果 不同的冻存时间、细胞代数对冻存后细胞的存活率没有明显影响；冻存复苏的神经干细胞不仅有较高的存活率，而且仍保持其原有的生物学特性。结论 成年大鼠神经干细胞的冻存并不影响其活力及原有的生物学特性。     

兔关节软骨细胞的分离培养及生物学特征

目的 探讨兔关节软骨细胞分离培养的方法和生物学特性。方法 从4周龄新西兰白兔关节分离培养软骨细胞，倒置显微镜下观察原代及传代培养的细胞形态学变化，并计数绘制生长曲线。测定细胞冻存复苏后的存活率。用甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法了解葡萄糖胺多糖（GAGs），Ⅱ型胶原的合成情况并鉴定细胞。结果 成功建立体外培养兔关节软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定，冷冻复苏存活率为92％。结论 本文建立的体外培养关节软骨细胞的方法简单可行。体外培养的兔软骨细胞表型能保持3代稳定，具有良好的生物学活性，可用于实验研究，可经深低温冷冻保存。     

海藻糖对脂肪细胞冻存后存活率的影响

目的：探讨海藻糖作为冻存保护剂对脂肪组织冻存后存活率的影响。方法：抽吸成年女性腹部或大腿脂 肪颗粒,经离心纯化后,分3组：海藻糖组、胎牛血清+10%DMSO组、生理盐水组。于–196 ℃下冻存3个月后,用HE 染色、葡萄糖转移法、肌酸激酶法检测脂肪细胞存活情况。结果：海藻糖组及胎牛血清+10%DMSO组脂肪细胞活性 均高于生理盐水组(P<0.05);海藻糖组与胎牛血清+10%DMSO组脂肪细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论：海 藻糖作为冻存保护剂能明显保持冷冻脂肪细胞活性,脂肪组织冷冻保存3个月后可用于临床移植。     

保存条件对恒河猴CD8~+T细胞活性的影响

目的通过细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining, ICS)检测CD8~+T细胞反应强度,探究不同保存条件对CD8~+T细胞活性影响。方法采集9只恒河猴外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),一部分新鲜细胞直接用于检测,剩余细胞冻存至-80℃和液氮,冻存1周和1年再用于检测,检测时用阳性刺激物进行刺激,流式分析活细胞比例,MIP-1β、TNF-α、IL-2、IFN-γ四种细胞因子分泌情况和细胞脱粒标志物CD107a的表达情况。结果随着冻存时间的增加,细胞存活率降低,且液氮冻存比-80℃冻存有更高的存活率。在细胞因子分泌和细胞脱粒标志物CD107a的表达情况中,冻存一年的细胞MIP-1β、TNF-α分泌量显著高于正常细胞,细胞状态发生了改变,冻存一周的细胞与新鲜细胞状态更为相近。结论想要保持低的细胞死亡率和正常的CD8~+T细胞反应,应使用新鲜细胞或短期冻存的细胞进行测量CD8~+T细胞反应水平的实验。     

人胎肝冻存后细胞成份的观察

有关新鲜胎肝细胞成份的研究,国内已有报导,但冻存后人胎肝细胞的分类,目前尚未见报导。为了解冻存对人胎肝细胞成份的影响,我们观察了5例人胎肝细胞冻存前、后分类的变化。一、材料与方法: 选用5例非病理性水囊引产的3～5个月胎儿。在无菌条件下取出肝脏,用TC-199液制备成单细胞悬液,涂片做瑞氏染色,为冻前组。胎肝细胞在液氮中(-196℃)冻存4～94天,取出立即放入40℃恒温水浴中快速解冻,取标本加入适量的RPMI1640培养液,打匀离心后弃上清,涂片瑞氏染色,     

姐妹染色单体差别染色效果相关因素的研究与改进

目的探讨影响姐妹染色单体差别染色效果的因素,明确作为课堂实验教学项目的可行性。方法用常规外周血淋巴细胞培养、染色体制备技术制备染色体标本片,细胞培养过程中分别加入新配制和-20℃保存10年的BrdU溶液。标本制备后分别取新鲜(1 d龄)和-20℃冻存1,2,3,4,5周龄的染色体片用紫外线照射,照射条件为50,56,60℃三种温度,10,20,30 min三个时间,然后Giemsa染色10 min。根据姐妹染色单体着色效果与色差评价各因素对差别染色的影响。结果在-20℃冻存10年的BrdU与新鲜配制的BrdU掺入DNA后的染色效果无显著差异,终浓度以10μg/ml为佳。新制备和-20℃保存1-5周的染色体标本片,在50-60℃的片温范围内,紫外照射10-30 min均获得良好的差别染色效果。结论BrdU溶液在-20℃长期冻存不影响DNA掺入效果;姐妹染色单体差别染色对相关因素容差性较强,改进后作为课内教学实验项目具有很好的可行性。     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

深低温在肝细胞移植中减轻免疫排斥反应的作用

目的：探讨深低温减轻肝细胞移植免疫排斥作用。方法：抗体依赖性细胞毒性（ＡＤＣＣ）检测猪肝细胞溶解率，圆二色测定其膜蛋白构象。移植新鲜或冻存猪肝细胞于肝衰鼠腹腔内，并行ＳＤ鼠冻存肝细胞同种移植，观察鼠存活率。结果：ＡＤＣＣ显示新鲜细胞数０．２４×１０５，冻存细胞０．６８×１０５；新鲜肝细胞膜蛋白中α螺旋为４７．５％，液氮处理后，α螺旋增至５６．５％。肝衰鼠３３．３％存活，新鲜猪肝细胞移植鼠６６．７％；移植冻存猪肝细胞后，存活率显著提高到９４．１％，但与ＳＤ鼠冻存肝细胞同种移植组（７１．４％）间无显著差异。结论：深低温使膜蛋白中α螺旋增加，并导致移植细胞的免疫反应原性降低；冻存肝细胞移植可提高急性肝衰治愈率。     

低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)冻存前与复苏后的生物学特性,为规模化储备UC-MSCs提供试验支持。方法采用胶原酶消化法从脐带中分离UC-MSCs,贴壁培养传代,将第3代UC-MSCs利用程控降温仪冷冻,置于-196℃液氮中冻存6个月后复苏,比较冻存前和复苏后UC-MSCs的细胞形态、生长曲线、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性。结果复苏后UC-MSCs仍呈成纤维样形态生长,生长曲线与冻存前相似;免疫表型仍高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、CD154、HLA-DR;在特定的体外诱导条件下,仍可以向骨、脂肪、软骨分化。结论冻存复苏后UC-MSCs的生物学特性仍保持稳定。     

松质骨骨基质明胶复合软骨细胞构建组织工程软骨

目的 观察软骨细胞在同种异体松质骨骨基质明胶(BMG)上的生长、增殖和分化,探讨用松质骨BMG与软骨细胞体外构建组织工程软骨的效果.方法 分离1月龄兔关节软骨细胞,扩增后种植在松质骨BMG上体外构建组织工程软骨.于1、2、4、6周取材进行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学及透射电镜观察.结果 软骨细胞在BMG上生长良好,分泌蛋白聚糖和胶原.随培养时间延长,细胞增殖,松质骨BMG空隙内细胞数量增多,软骨陷窝形成,基质分泌增强.培养6周时软骨细胞在BMG表面及孔隙内形成软骨样组织,免疫组织化学染色显示细胞周围基质富含Ⅱ型胶原,分布均匀:透射电镜显示软骨细胞超微结构正常,细胞周围有大量基质产生.结论 同种异体松质骨BMG可以促进软骨细胞的生长增殖,维持软骨细胞的分化表型;在体外成功构建了组织工程软骨,它是一种较好的软骨组织工程支架材料.

Abstract：

Objective To evaluate the use of cancellous bone matrix gelatin (BMG) combined with chondrocytes in constructing tissue-engineered cartilage by observing the growth, proliferation and differentiation of chondrocytes on allogeneic cancellous BMG. Methods The articular chondrocytes isolated from a 1-month-old rabbit were multiplied to a monolayer and seeded onto cancellous BMG to construct tissue-engineered cartilage in vitro during a period of 6 weeks. Samples were taken from the construct after 1, 2,4, and 6 weeks of culture and evaluated by histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). Results The chondrocytes excreted matrix proteoglycan and collagen on cancellous BMG. With the prolongation of the culture time, the cells proliferated in the construct and the cells in the lacunae increased. Numerous chondrocytes were present the central region of the cancellous BMG and surrounded by extracellular matrix. By 6 weeks of culture, the BMG was covered with 15-20 layers of chondrocytes and cartilaginous tissue occurred in the pores throughout the cancellous BMG. Immunohistochemical staining showed rich and evenly distributed type Ⅱ collagen around the chondrocytes, and TEM revealed an ultrastructure of the chondrocyte similar to that of native chondroctyes, with abundant extracellular matrix produced around the cells. Conclusion Tissue-engineered cartilage can be constructed in vitro using allogeneic cancellous BMG combined with chondrocytes. Allogeneic cancellous BMG serves as a good scaffold material for tissue-engineered cartilage to promote the growth and proliferation of the seeded chondrocytes and allows maintenance of the differentiation phenotype of the cells.     

超低温冻存对人骨髓基质干细胞生物学特性的影响

目的 观察超低温冻存对人骨髓基质干细胞(BMSC)生物学特性的影响. 方法 从正常献髓者髂骨采集骨髓,分离培养出BMSC,并对其进行成骨诱导培养.将第4代人BMSC经短期超低温冻存、复苏后,通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能、碱性磷酸酶(ALP)活性检测及体外矿化能力比较,观察超低温冻存对人BMSC生物学特性的影响.结果 第4代人BMSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、生长过程、ALP活性等方面均无显著性差异(P＞0.05).结论 短期的超低温冻存对人BMSC的生物活性无明显影响.     

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的: 比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法： 采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。结果： 随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论： 经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。     

人胎大脑皮质细胞的冷冻保存

目的：筛选人胎大脑皮质细胞冷冻保存的适宜条件。方法：将胎龄４～６月人胎大脑皮质制成细胞悬液并分别保存于４℃和液氮中，分别于保存第１ｄ，５ｄ，１５ｄ和３０ｄ用台盼蓝染色法观察细胞存活率。结果：①胎龄４～６Ｍ人胎大脑皮质细胞在冷存后均可存活，以胎龄４Ｍ细胞存活率较高。②冷存１ｄ～５ｄ时，４℃保存的细胞存活率高于液氮保存的细胞存活率，但随着保存时间的延长细胞存活率显著下降。③冷存１～３０ｄ时，液氮保存的细胞存活率无明显变化，且在１５ｄ和３０ｄ时细胞存活率明显高于４℃保存者。结论：人胎大脑皮质细胞的保存条件以胎龄４Ｍ、４℃短期保存和慢速冷冻、快速复温的液氮长期保存为宜。     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

兔软骨细胞的分离培养及其生物学特征的检测

目的探讨兔关节软骨细胞分离培养方法和生物学特征。方法采用酶消化法分离获取软骨细胞，通过倒置显微镜下观察、绘制生长曲线、组织化学染色及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等方法了解其生物学特性。结果分离获取细胞活性率可达98％以上，原代细胞和第1代细胞以三角形或多角形为主，生长融合时呈卯圆形，甲苯胺蓝染色呈阳性。第3代以后细胞出现反分化现象。结论本方法是一种方便且有效的培养法。     

体外兔骨髓基质干细胞软骨方向诱导

目的　探讨兔骨髓基质干细胞 (bonemesenchymalstemcell ,BMSC)体外定向软骨样分化的有效诱导条件及相关生物学特性。方法　选用 8周新西兰大白兔 ,于胫骨或股骨抽取骨髓 ,经梯度离心、培养、扩增 ,取第 3代BMSC按一定比例种植于 6孔板中 ,并加入含有转化生长因子 β1、地塞米松和维生素C的培养液。于不同时间点取材固定 ,甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化鉴别。结果　在诱导液作用下 ,BMSC增殖速度逐渐减慢 ,其形态由梭形变为圆形 ,但合成类软骨基质增多 ,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和II型胶原免疫组化阳性。结论　在本实验条件下 ,获取的兔BMSC生长稳定 ,增殖快 ,并成功地诱导其向软骨细胞表型转化     

JNK phosphorylation promotes degeneration of cervical endplate chondrocytes throughdown-regulation of the expression of ANK in humans

Background C-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway and ankylosis gene (ANK) play a critical role in endplate chondrocytes degeneration.The purpose of this study was to investigate whether the expression levels of ANK was associated with the activation of JNK.Methods Cartilage endplates of 49 patients were divided into the control group (n=19) and the experimental group (n=30).The patients in the control group were graded 0 and those in the experimental group were graded Ⅰ-Ⅲ according to Miller's classification.Endplate chondrocytes were isolated by enzyme digestion and cultured in vitro.The inverted phase contrast microscope,teluidine blue staining,HE staining,real time RT-PCR,and MTT were used to observe morphological appearances,biological characteristics,and growth curve of endplate chondrocytes from the cartilage endplate of the two groups.Real time RT-PCR and Western blotting were used to analyze the mRNA and protein expression levels of associated factors in the degeneration process in the cultured endplate chondrocytes with or without subjected SP600125.Results The expression levels of type Ⅱ collagen,aggrecan,and ANK in endplate chondrocytes of experimental group were lower than that of control group and phosphorylation level of JNK in the experimental group which was higher than that in the control group.Application of JNK phosphorylation inhibitor to degeneration chondrocytes resulted in a marked decrease in the phosphorylation level of JNK and a significant increase in the expression levels of type Ⅱ collagen,aggrecan,and ANK.Conclusion The degeneration of the human cervical endplate chondrocytes might be promoted by JNK phosphorylation by down-regulating the expression of ANK     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.