多柔比星诱导白血病细胞耐药产生的机制研究

目的:观察多柔比星诱导人白血病细胞系K562产生耐药的规律,初步探讨耐药产生的机制.方法:在设定的浓度梯度和作用时间下,用多柔比星处理K562细胞,采用RT-PCR法测定mdr-1基因及其他耐药相关基因的表达;运用流式细胞仪检测mdr-1基因编码的P糖蛋白(P-gp)的表达水平,用免疫荧光染色检测细胞凋亡相关蛋白Survivin的表达.结果:多柔比星在体外能诱导K562细胞产生耐药性,随着多柔比星作用浓度的增加和时间的延长,K562中mdr-1及P-gp的表达逐渐上调,MRP,Topo Ⅱ,YB-1和NF-kappaB基因的表达亦有改变,GST则无明显变化,凋亡相关基因Survivin及其编码的蛋白在耐药产生过程中表达亦上调.结论:多柔比星以剂量和时间依赖性方式诱导K562细胞产生耐药,多种耐药相关基因参与诱导耐药的形成,凋亡相关基因的表达改变亦是其耐药形成机制之一.     

选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398下调K562/ADM细胞MDR1/P-gp表达

目的 探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对白血病多药耐药K562/ADM细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法 以细胞K562/ADM为NS-398作用的靶细胞,MTT法检测细胞增殖活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因(MDRl)mRNA的表达;流式细胞仪(FCM)测定P-gp蛋白表达水平.结果 NS-398显著抑制K562/ADM细胞增殖,呈时间、剂量正相关效应;下调K562/ADM细胞MDRl基因表达并抑制P-gp合成,呈明显的剂量依赖关系.结论 COX-2抑制剂NS-398可在一定时间和剂量范围抑制白血病多药耐药K562/ADM细胞MDRl/P-gp表达,并能抑制K562/ADM多药耐药细胞增值.     

X射线照射后鼻咽癌细胞多药耐药基因的表达

目的 通过检测射线照射前后鼻咽癌CNE1细胞多药耐药基因(mdr1基因)及其编码产物P糖蛋白(P-gp)的表达和功能为临床鼻咽癌放化疗顺序提供参考。方法 利用RT-PCR、Western blotting和流式细胞仪检测射线照射前后CNE1细胞的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素的外排功能。结果 鼻咽癌CNE1细胞射线照射前mdr1基因、P-gp不表达；照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达；对柔红霉素的摄取较射线照射前低。结论 鼻咽癌CNE1细胞射线照射后化疗敏感性降低，提示临床对于中晚期鼻咽癌的治疗应考虑先化疗再放疗即诱导化疗的治疗方案。     

糖尿病患者多药耐药基因mdr1的表达

目的：体外观察糖尿病患者肝细胞诱导发生胰岛素抵抗（IR）中多药耐药基因mdr1的表达。方法：采用高浓度胰岛素诱发肝源性细胞HepG2建立IR细胞模型（HepG2 IR细胞）,GOD-POD微量化法测定葡萄糖消耗量,RT-PCR检测胰HepG2 IR细胞mdr1基因和胰岛素受体（InsR）mRNA的表达,流式细胞术（FCM）检测P-糖蛋白（P-gp）和InsR蛋白水平。结果：胰岛素诱发HepG2发生IR后,HepG2 IR细胞葡萄糖消耗量降低约10%～45%,InsR基因mRNA表达显著下调、受体表达量降低50.2%～82.9%。胰岛素诱导HepG2细胞产生抗性的过程中,耐药基因mdr1基因表达同步显著增强,mRNA转录增高0.7～2.1倍,P-gp表达阳性细胞增加0.6～1.7倍、表达强度增高。结论：胰岛素诱发的肝脏胰岛素抵抗细胞mdr1基因和P-gp的表达显著增强,提示耐药基因可能与胰岛素抵抗相关联。     

两种不同分化程度的鼻咽癌细胞在化疗药物作用前后多药耐药基因的表达

目的 检测鼻咽癌CNE1和CNE2细胞在阿霉素(adriamycin,ADM)作用前后多药耐药基因(mdr1 基因)及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是否表达及功能变化.方法 利用RT-PCR,Western blotting和流式细胞仪(FCM)检测CNE1和CNE2细胞在阿霉素作用前后的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素(daunorubicin,DNR)的外排功能.结果 鼻咽癌CNE1和CNE2细胞在阿霉素作用前mdr1基因、P-gp不表达;阿霉素作用后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达,对柔红霉素的蓄积较阿霉素作用前低.结论 化疗可能诱导鼻咽癌细胞的多药耐药.     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/A02耐药的机制

目的:研究汉防己甲素（TTD）对白血病细胞株K562/A02多药耐药(MDR)逆转的机理。方法：以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为TTD作用的靶细胞。细胞水平检测实验分5组（K562组、K562/A02组、K562+ADM组、K562/A02+ADM组和K562/A02+TTD+ADM组）,采用MTT法检测TTD对K562和K562/A02细胞的非细胞毒性剂量,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADM)的浓度,基因、酶学、蛋白水平检测实验分3组（K562组、K562/A02组和K562/A02+TTD组）,采用RT-PCR法检测mdr1 mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）和拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）的表达水平,Western-blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）和bcl-2表达。结果：1.562 5 mg•L^-1的TTD处理K562/A02细胞后,细胞内ADM的浓度较单用ADM组明显提高（P<0.01）;与空白对照组比较,K562/A02细胞内mdr1 mRNA/P-gp的表达量减少（P<0.01）;GST-π和TopoⅡ表达无明显变化;凋亡抑制基因bcl-2的表达量减少（P<0.01）。结论:TTD主要通过增加细胞内ADM浓度,下调mdr1/P-gp和bcl-2表达逆转耐药。     

靶向mdr1b/mdr1a基因siRNA逆转T24/ADM多药耐药性研究

目的:研究mdr1b/a基因siRNA(small interfering RNA)逆转膀胱癌的多药耐药性。方法:设计mdr1b/a基因的siRNA,转染膀胱癌T24/ADM细胞,用RT-PCR分析mRNA的表达,Rh123分析P-gp活性,流式细胞仪检测细胞内阿霉素积累量。结果:siRNA能明显地逆转T24/ADM细胞的多药耐药,使mdr1b/a基因的mRNA表达水平下调,细胞内阿霉素积累量显著增加(P<0.05)。结论:mdr1b/a基因siRNA能够逆转膀胱癌的多药耐药性。     

mdr1单因素耐药白血病细胞株的构建

目的 构建mdrl单因素耐药白血病细胞株,为研究RNA干扰逆转mdr1所致耐药提供细胞模型。方法 将含mdr1 cDNA全长的真核表达载体通过脂质体转染人对化疗药物敏感的K562细胞内,G418筛选获得转基因单克隆细胞．用RT-PCR检测有无mdr1表达、流式细胞技术检测细胞表面P-gp蛋白含量、Rh123泵出实验检测P-gp功能、MTT检测细胞对药物的敏感性。结果 转mdr1基因细胞K562／mdr1能较高水平表达mdr1,明显表现出对化疗药物的耐药性。结论 通过转基因方法构建mdr1单因素耐药细胞株可为RNA干扰逆转mdr1提供更精确的细胞研究模型。     

RNA干扰逆转白血病细胞耐药性的研究

目的 用RNA干扰技术下调白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药基因mdr1的表达以逆转白血病对化学药物的耐药性.方法 针对mdr1基因已知mRNA序列不同位点,选择两条靶序列,构建靶向mdr1 shRNA真核表达载体,脂质体介导转染白血病耐药细胞株K562/A02.实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达,Western blot检测细胞膜P-gp表达,柔红霉素泵出试验检测P-gp外排泵功能,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性.结果 构建了二条针对mdr1基因的shRNA真核表达载体,分别下调mdr1 mRNA的表达89.74%和87.18%,降低细胞膜P-gp表达,使膜外泵功能明显下降,柔红霉素在细胞内贮留明显增多,60min 时柔红泵出率为13.16%、22.02%,对照组为40.44%、45.31%,对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为84.36%和76.69%.结论 RNA干扰技术可有效逆转mdr1所致耐药.     

shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制.方法:针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1,2,3,采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞,RT-PCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1,MRP1,topoⅡ,GST的mRNA水平;蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平;MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度(IC50值).结果:K562/A02细胞VEGF mRNA表达水平显著高于敏感株K562细胞,差异有统计学意义(P<0.01),且VEGF蛋白水平也显著高于K562细胞;转染shRNA后,K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调,其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义(P<0.05),以shRNA3组下调最显著,并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调;转染48 h后K562/A02细胞中MDR1,MRP1及topoⅡ的mRNA水平均出现不同程度下调,以shRNA3组下调最显著,分别下调(39.7±1.21)%,(29.1±0.97)%,(28.2±1.04)%,GST基因表达则无明显变化;阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加,其中以shRNA3组最显著.结论:VEGF shRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达,不同干扰片段的沉默效果不同,并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,其机制可能与MDR1,MRP1及topo Ⅱ的表达下调有一定的关系.     

Expression of the human multidrug resistance gene mdr1 in leukemic cells and its application in studying P-glycoprotein antagonists

Objective To explore the role of endothelin (ET) in the pathogenesis of exercise-induced asthma (EIA), we investigated the effects of ET(B) receptor antagonists, ET-1 (11-21)fragment and N-cis-2,6-dimethylpi-peridinocardonyl-L-γ-methylleucyl-D-1-methoxycarbonyl tryptophanyl-D-norleucine (BQ788) on broncho-constriction elicited by isocapnic hyperpnea in guinea pigs. Methods Eighteen pathogen-free Hartley guinea pigs were randomly divided into three groups. A: normal saline (NS) inhalation control group (n=6), B: BQ788 group (n=6), and C: ET-1(11-21) fragment group (n=6). Guinea pigs were anesthetized with pentobarbital sodium. After measuring the basal value of lung resistance (R[L]) and dynamic compliance of the respiratory system (Cdyn), NS (0.96 ml), BQ788 (9 nmol) and ET-1(11-21)fragment (9 nmol) were inhaled. A rodent respirator with a dry 5%CO(2)-95%O(2) mixture at room temperature provided mechanical ventilation (V[T] 8 ml/animal, 100 breaths/min) for 5 min. R[L] and Cdyn of the 3 groups were measured again after isocapnic hyperpnea challenge. Results In the control group, isocapnic hyperpnea of dry gas elicited a marked increase in R[L] and decrease in Cdyn. R[L] and Cdyn of the guinea pigs from BQ788 group and ET-1(11-21)fragment group did not change significantly. Conclusion It was demonstrated that selective ET(B) receptor antagonists, ET-1(11-21) fragment and BQ788, inhibited the bronchoconstriction induced by isocapnic hyperpnea in guinea pigs. The data showed that ETs are potent constrictors of guinea pig airway smooth muscle via a direct effect on ET receptors. It was suggested that ET receptor antagonists, especially ET(B) receptor antagonist, might be beneficial in preventing EIA.     

甲基莲心碱联合mdr 1shRNA对K562/A02 细胞mdr 1/P gp表达的影响

目的：探讨甲基莲心碱(Nef)联合mdr 1shRNA表达的载体对K562/A02细胞mdr 1/ P gp表达的影响。 方法：采用MTT方法比较Nef,mdr 1shRNA单独或二者联合对K562/A02细胞增殖的抑制作用;采用RT PCR和Western印迹法检测mdr 1/P gp的表达。 结果：Nef与mdr 1shRNA联合组对K562/A02细胞的抑制率显著高于mdr 1shRNA,Nef单独处理组(P＜0.01);联合组对K562/A02细胞mdr 1/P gp表达的抑制作用强于单独处理组（P＜0.01）。 结论：甲基莲心碱能增强mdr 1shRNA表达载体对K562/A02细胞的增殖抑制作用及mdr 1/P gp表达的抑制作用,逆转mdr 1基因编码蛋白P gp介导的多药耐药。     

用逆转录多聚酶链反应法检测多药耐药基因（mdr1）的表达

以长春新碱诱导的耐药细胞Ｋ５６２／ＶＣＲ和阿霉素诱导的耐药细胞Ｋ５６２／ＤＯＸ及敏感细胞Ｋ５６２作为检测对象，采用逆转录多聚酶链反应法，并且以β２－微球蛋白（β２ｍ）基因作为内参照，检测和比较了上述细胞的多药耐药基因ｍｄｒ１表达。经过３０个循环扩增，耐药细胞检测出ｍｄｒ１和β２ｍ基因的扩增产物，而敏感细胞无ｍｄｒ１扩增产物。结果提示，本方法可用以区分耐药和敏感细胞，有希望成为临床个体化疗敏感性预测的重要指标之一。     

亚砷酸对白血病K562/A02细胞的作用及机制

目的研究亚砷酸对白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞的作用及对多药耐药基因1（mdr1）、P糖蛋白（P-gp）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨亚砷酸逆转白血病多药耐药（MDR）的作用机制。方法将K562/A02细胞与不同浓度的亚砷酸（0、0.5、2.0、5.0μmol/L）共同孵育,分别在24、48、72h时,用Wrights染色法观察K562/A02细胞形态,流式细胞术（FCM）检测凋亡细胞,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR法检测mdr1mRNA的表达,免疫组织化学法观察P-gp表达,并用ELISA法检测VEGF的浓度。结果随着亚砷酸作用浓度和时间的增加,K562/A02细胞的数目减少,并出现凋亡形态学改变,FCM显示随着作用浓度和时间的增加,细胞凋亡率逐渐上升;从作用48h组开始,mdr1mRNA及P-gp的表达出现显著降低（P〈0.05）,mdr1mRNA条带颜色较空白对照组明显变浅,mdrl/GAPDH灰度比值下降,此时,P-gp的灰度值上升,且随亚砷酸作用浓度和时间的增加,mdr1mRNA条带颜色进一步变浅,表达水平进一步下降;ELISA法检测表明从0.5μmol/L作用24h组开始,VEGF浓度即下降至405.02pg/mL（P〈0.05）,相同作用时间下以5.0μmol/L组较其它浓度组下调VEGF的作用最为显著。结论亚砷酸呈药物浓度-时间依赖性抑制K562/A02细胞增殖,诱导其凋亡,下调VEGF表达,有效抑制了mdrlmRNA的产生和P-gp的合成。     

STI571 combined with vincristine greatly suppressed the tumor formation of multidrug-resistant K562 cells in a human-nude mice xenograft model

Multidrug resistance (MDR), often associated with decreased intracellular drug accumulation in patient's tumor cells resulting from enhanced drug efflux,1 is a major obstacle to successful chemo- therapy in leukemia. It is related to the overexpression of a membrane protein, P- glycoprotein (P-170), thereby reducing drug cytotoxicity. For example, Philadelphia-chromo- some-positive (Ph+) chronic myelogenous leukemia (CML) is often resistant to chemotherapy in advanced phases because of the…     

慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性探讨

目的 探讨慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性.方法 采用Real-time PCR检测MDR1 mRNA表达,Western-blot检测P-gp蛋白表达,MTS法检测细胞药物敏感性.结果 耐伊马替尼细胞株K562/G01MDR1的mRNA表达明显上调,P-gp表达明显上调,维拉帕米能部分逆转K562/G01细胞株对伊马替尼的耐药.结论 MDR1基因参与伊马替尼耐药机制,P-gp抑制剂能改善伊马替尼临床疗效.     

白血病耐药细胞中多药耐药基因MDR1与核转录因子κB的关系

目的:研究核转录因子κB与多药耐药基因MDR1在白血病化疗耐药中的作用,阐明核转录因子κB(NF-κB)与白血病多药耐药的关系及相关分子机制。方法：白血病细胞K562和阿霉素(ADM)诱导的耐药细胞K562/ADM分别应用ADM（0、0.25、0.50、1.00和2.00 μg·L^-1）或丝裂霉素(MIT)（0、2、4、8和16 mg·L^-1）　作用48 h,通过MTT法检测细胞生存率,计算细胞耐药指数;RT-PCR方法检测MDR1和IκB mRNA表达;Western blotting方法检测P-gp和P65的蛋白表达。结果：ADM和MIT分别作用后,与空白对照组比较,白血病细胞K562细胞生存率下降(P<0.01),呈剂量依赖性;ADM和MIT对耐药细胞K562/ADM生存率作用不明显;在mRNA水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的MDR1 mRNA高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00　 μg·L^-1>或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562细胞和K562/ADM细胞,IκBα mRNA表达均下降(P<0.01),并呈剂量依赖性;在蛋白水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的P-gp蛋白高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00 μg·L^-1或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562/ADM细胞,P-gp蛋白表达量升高(P<0.01),同时P65蛋白表达量升高,且呈药物剂量依赖性(P<0.01)。结论：MDR1基因及P-gp蛋白的高表达很可能是白血病细胞K562多药耐药性形成的关键机制,而NF-κB的激活可能参与了多药耐药的调控。