Akt1在颞叶癫痫大鼠海马中的表达变化

目的研究颞叶癫癎模型海马区神经元Akt1表达变化,探讨其在癫癎发生发展中的作用。方法采用氯化锂-匹罗卡品方法制备颞叶癫癎大鼠模型,Western blotting检测海马区总蛋白、Quantity one软件行灰度值分析;免疫组织化学染色观察海马各区Akt1蛋白表达变化,计数不同处理组阳性神经元数目。结果 Western blotting检测结果显示,与正常对照组相比,癫癎模型组大鼠于癫癎持续状态发作即刻海马区Akt1蛋白表达升高(t=2.445,P=0.034),并于第30天时达峰值水平(t=1.214,P=0.002),发作后24 h表达水平迅速降低,并低于正常值范围(t=4.294,P=0.000),其余各测量时间点表达无明显改变;与氯化锂组相比,癫癎模型组大鼠于癫癎持续状态后1h海马区Akt1蛋白表达开始降低,24 h降至最低水平(t=4.134,P=0.000),至发作48 h后开始逐渐升高(t=2.481,P=0.002),并于发作第7天时升至氯化锂组水平。免疫组织化学染色显示,癫癎持续状态发作后海马CA3区Akt1蛋白表达阳性神经元数目立即增加,12h达高峰(t=16.586,P=0.000),48 h减少并降至正常值水平(t=0.357,P=0.089),发作后第10天再次增加(t=3.123,P=0.000),于第30天时阳性神经元数目再次达峰值水平(t=18.339,P=0.000),第50天开始恢复至正常值水平(t=3.219,P=0.000);氯化锂组仅海马CA3区Akt1蛋白表达于实验初始(0 h)升高并高于正常对照组(P<0.05),海马CA1和CA2区Akt1蛋白表达变化组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论海马及海马CA3区Akt1蛋白表达均呈现癫癎持续状态后升高、降低、再升高的动态过程,提示可能存在神经元保护作用,对抗细胞凋亡、促进细胞存活。     

雌激素对癫痫持续状态大鼠海马CA3区神经元保护作用的研究

目的研究雌激素对癫癎持续状态大鼠海马CA3区神经元保护作用.方法利用尼氏染色和免疫组化染色技术,观察癫癎发作前后给予雌激素治疗对癫癎发作造成神经元凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响.结果癫癎发作前给予雌激素治疗可明显减轻持续癫癎发作造成的神经元缺失并可抑制Bax表达,但对Bcl-2表达无明显影响.结论雌激素对癫癎持续状态导致的海马神经元损伤有保护作用,对凋亡促进基因Bax表达的影响可能参预了其神经保护作用.     

匹罗卡品致(癎)大鼠海马γ-氨基丁酸能中间神经元生长抑素和微清蛋白mRNA表达研究

目的 观察匹罗卡品致(癎)大鼠海马γ-氨基丁酸能中间神经元生长抑素(SS)mRNA和微清蛋白(PV)mRNA表达水平变化,拟从基因水平探讨其表达阳性γ-氮基丁酸能中间神经元在颞叶癫(癎)发生发展中的作用.方法 建立匹罗卡品致(癎)大鼠模型,采用原位杂交法检测各观察时间点海马SSmRNA和PVmRNA表达阳性神经元数目.结果 模型组大鼠海马各区γ-氨基丁酸能中间神经元SSmRNA表达水平均于出现癫(癎)持续状态后3d降低最为显著(均P=0.000),随后逐渐升高;至发病后60d,海马CA3区SSmRNA表达水平高于对照组(t=1.021,P=0.005),海马门区(t=3.211,P=0.009)和CA1区(t=1.902,P=0.048)则仍低于对照组.模型组大鼠海马门区γ-氨基丁酸能中间神经元PVmRNA表达水平于出现癫(癎)持续状态后6h开始降低,至发病后60d降低最为显著(均P=0.000);海马CA1区PVmRNA表达水平于发病后3d降低最为显著(均P=0.000),随后逐渐升高但仍低于对照组(江2.216,P=0.048);癫(癎)持续状态早期,海马CA3区PVmRNA表达水平无明显变化,至发病后7d逐渐升高且高于对照组(t=1.021,P=0.005).结论 γ-氨基丁酸能中间神经元SSmRNA和PVmRNA表达水平的下调可能在颞叶癫(癎)的发生中起重要作用,至慢性期γ-氨基丁酸能中间神经元SSmRNA和PVmRNA表达水平的恢复或上调可能与颞叶癫(癎)的发展或修复有关.γ-氨基丁酸能中间神经元数目的 变化,部分是由于其标志物mRNA表达水平的调节所致,并非神经元数目变化的唯一因素.     

颞叶癫痫大鼠海马区NR2B／PSD-95的动态表达变化

目的:观察N-甲基-D-天冬氨酸受体2亚基B(NR2B)和突触后致密物95(PSD-95)蛋白在锂-匹罗卡品致大鼠海马表达的动态变化,探讨其在颞叶癫癎发生、发展中的作用。方法:采用锂-匹罗卡品颞叶癫癎大鼠模型,用免疫组织化学法观察不同时间点大鼠海马CA1、CA3、DG区NR2B和PSD-95蛋白表达。结果:NR2B和PSD-95蛋白在大鼠海马分布广泛,表达丰富;大鼠腹腔注射锂-匹罗卡品后,NR2B和PSD-95蛋白在海马各区表达逐渐减少,24h降至低谷,与对照组比较差异有显著意义(P<0.01);此后逐渐回升,但仍低于对照组;30d在海马CA1、CA3区表达再次降低,与对照组比较有显著意义(P<0.05)。结论:NR2B和PSD-95蛋白表达下调可能分别参与颞叶癫癎急性期和慢性自发发作期的保护性机制。     

匹罗卡品致癎大鼠海马γ-氨基丁酸能中间神经元生长抑素和微清蛋白mRNA表达研究

目的观察匹罗卡品致癎大鼠海马γ-氨基丁酸能中间神经元生长抑素（SS）mRNA和微清蛋白（PV）mRNA表达水平变化,拟从基因水平探讨其表达阳性叮一氨基丁酸能中间神经元在颞叶癫癎发生发展中的作用。方法建立匹罗卡品致癎大鼠模型,采用原位杂交法检测各观察时间点海马SSmRNA和PVmRNA表达阳性神经元数目。结果模型组大鼠海马各区吖．氨基丁酸能中间神经元SSmRNA表达水平均于出现癫癎持续状态后3d降低最为显著（均P=0．000）,随后逐渐升高;至发病后60d,海马CA3区SSmRNA表达水平高于对照组（t=1．021,P=0．005）,海马门区（t=3．211,P=0．009）和CA1区（t=1．902,JP=0．048）则仍低于对照组。模型组大鼠海马门区γ-氨基丁酸能中间神经元PVmRNA表达水平于出现癫癎持续状态后6h开始降低,至发病后60d降低最为显著（均P：0．000）;海马CA1区PVmRNA表达水平于发病后3d降低最为显著（均p=0．000）,随后逐渐升高但仍低于对照组（t=2．216,尸：0．048）;癫癎持续状态早期,海马CA3区PVmRNA表达水平无明显变化,至发病后7d逐渐升高且高于对照组（t=1．021,P=0．005）。结论γ-氨基丁酸能中间神经元SSmRNA和PVmRNA表达水平的下调可能在颞叶癫癎的发生中起重要作用,至慢性期γ-氨基丁酸能中间神经元SSmRNA和PVmRNA表达水平的恢复或上调可能与颞叶癫癎的发展或修复有关。γ-氨基丁酸能中间神经元数目的变化,部分是由于其标志物mRNA表达水平的调节所致,并非神经元数目变化的唯一因素。     

喹啉对癫(癎)大鼠海马神经元连接蛋白36表达的影响

目的:探讨喹啉对癫癎大鼠海马神经元连接蛋白36(Cx36)表达的影响.方法:64只SD大鼠随机分为正常对照组、癫癎模型组、地西洋治疗组和喹治疗组,每组16只大鼠.采用氯化锂-匹罗卡品诱导制作癫癎大鼠模型,地西泮治疗组子以1mg/kg地西泮治疗,喹啉治疗组予以60mg/kg喹啉治疗.术后分别采用Racine评分和脑电图检查判断癫癎发作情况.分别用免疫荧光染色法、Western blot法检测各组大鼠术后2h、4h时海马神经元Cx36的表达.结果:与正常对照组比较,癫癎模型组和地西泮治疗组大鼠术后2h、4h时海马神经元Cx36表达水平显著升高(均P<0.01).癫癎模型组和地西泮治疗组大鼠术后2h、4h时海马神经元Cx36表达水平比较差异无统计学意义.与癫癎模型组及地西泮治疗组比较,喹啉治疗组大鼠术后2h、4h时海马神经元Cx36表达水平显著降低(均P<0.01).结论:癫癎大鼠海马神经元Cx36表达水平升高,喹啉能抑制这一变化.     

应用Fluoro-Jade C评价匹罗卡品模型丘脑神经变性

目的 应用Fluoro-Jade C(FJC)染色方法 观察小鼠匹罗卡品癫(癎)模型丘脑神经元变性情况,以了解丘脑结构在慢性颞叶癫痫发生中的病理变化和癫(癎)反复发作的神经学基础.方法 以盐酸匹罗卡品腹腔注射(220 mg/kg)制备小鼠癫痼持续状态模型.脑组织切片经FJC染色后.荧光显微镜下观察FJC阳性细胞形态和在丘脑的整体分布情况.结果 匹罗卡品模型组小鼠FJC阳性细胞呈神经元形态,丘脑结构损害呈连续性.功能不同的丘脑核其细胞损害程度有所不同.结论 采用FJC染色技术观察匹罗卡品癫(癎)持续状态小鼠模型丘脑神经元变性情况,有利于更好地理解颞叶癫(癎)的中枢神经系统长期病理变化和自发性反复发作机制.     

不同化学致癇剂对大鼠癫癇发作和神经元凋亡的影响

目的观察几种不同癫癇持续状态模型发作的特点和海马区的组织病理学改变.方法采用匹罗卡品、锂-匹罗卡品和戊四氮腹腔注射制成大鼠癫持续状态模型,以TUNEL方法标记DNA片段,原位检测海马CA1和CA3区的凋亡神经细胞.结果海马CA1和CA3区神经细胞凋亡数,PILO组多于Li-PILO组和PTZ组,差异有显著性(P《0.05).结论匹罗卡品、锂-匹罗卡品和戊四氮均可诱发大鼠癫持续状态,并导致海马神经元损伤.     

颞叶癫大鼠海马轴突导向分子Sema3F及其受体Np2表达的变化

目的 研究颞叶癫(癎)大鼠海马轴突导向分子Sema3F及其受体Np2表达的变化.方法 给SD大鼠腹腔注射匹罗卡品、氯化锂制作颞叶癫(癎)模型.用免疫组化法和原位杂交技术对致(癎)后不同时间点大鼠海马CA1区、CA3区、齿状回的Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白表达进行检测,并与正常对照组比较.结果 颞叶癫(癎)大鼠致(癎)后7 d、15 d,海马CA1区、CA3区Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白的表达明显低于正常对照组(P＜0.05～0.01), 致(癎)后30 d、60 d表达与正常对照组差异无统计学意义;而齿状回Sema3F mRNA、Np2 mRNA和蛋白的表达与正常对照组的差异无统计学意义.结论 颞叶癫(癎)大鼠海马CA1区、CA3区Sema3F、Np2表达在致(癎)后早期明显下调,而在慢性期恢复正常.     

颞叶癫(癎)大鼠海马中miRNA表达谱的检测和分析

目的 探讨颞叶癫(癎)大鼠海马组织中miRNA分子表达谱的差异,为进一步研究相关miRNA在颞叶癫(癎)发病机制中的作用打下基础.方法 对同一父系和母系的子代大鼠,利用氯化锂-匹罗卡品化学诱导方法制备慢性颞叶癫(癎)大鼠模型.分别提取1只正常和3只颞叶癫(癎)大鼠海马组织的miRNA,采用高通量的miRNA微阵列芯片杂交,筛选颞叶癫(癎)海马组织中差异表达的内源性miRNA.结果 在大鼠海马组织中共检测到125个miRNA基因.与正常大鼠相比,颞叶癫(癎)大鼠海马组织中差异表达的miRNA有23个,其中有5个miRNA下调,18个miRNA上调.结论 与正常大鼠相比,颞叶癫(癎)大鼠海马组织中存在差异表达的miRNA分子,差异表达的miRNA分子可能参与癫(癎)的发病过程,具有潜在的研究价值.     

凋亡调控基因在难治性颞叶癫痫患者脑中表达的研究

目的:探讨神经元凋亡与难治性癫痫患者海马硬化关系。方法:16例颞叶癫痫患者手术标本,用光镜、电镜及原位末端标记(TUNEL)方法检测神经元凋亡;应用免疫组化方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:对照组未发现凋亡神经元;癫痫组在电镜检查的3例标本中,1例有少量早期凋亡征象。对照组Bcl-2蛋白无表达,癫痫组Bcl-2蛋白表达明显增强(P<0.001);Bax蛋白在癫痫组与对照组中均微弱表达,两者差异无统计学意义(p>0.5)。结论:凋亡基因Bcl-2、Bax参与癫痫过程。     

Upregulation of dysbindin in temporal lobe epileptic foci of human and experimental animals

The gene encoding dystrobrevin-binding-protein-1 (dysbindin) is expressed in many areas of the central nervous system and plays a role in intracellular vesicle trafficking, synaptic vesicle trafficking, and neurotransmitter release. At a cellular level, dysbindin is thought to mediate presynaptic glutamatergic transmission. Using Western blotting and immunofluorescence, we investigated dysbindin expression in brain tissues of the patients with temporal lobe epilepsy (TLE) and rats with TLE (lithium chloride pilocarpine model) to explore its possible role in epileptogenesis. Twenty-five samples of temporal neocortex from patients undergoing surgery for drug-refractory TLE epilepsy and 10 histologically normal temporal lobes tissues from control subjects were used in our study. We also examined dysbindin expression in the hippocampus and adjacent cortex from experimental Sprague-Dawley rats. Dysbindin was expressed in the cytoplasm of neurons from epileptic specimens, and levels of dysbindin proteins were significantly increased in patients with TLE. Dysbindin was also expressed in the neurons of the hippocampus and adjacent cortex from experimental and control rats. Western blotting of rat brain tissue showed that dysbindin was upregulated gradually from 6 h after kindling. Maximal expression was seen around 2 months in chronic epileptic phase. These results demonstrated that the increased expression of dysbindin might play a role in the pathogenesis of drug-refractory TLE.     

钙拮抗剂对大鼠缺血性脑损伤后Bcl-2和Bax基因表达的作用

目的探讨大鼠实验性脑缺血后海马组织Bcl-2和Bax基因的表达及尼莫地平预处理对Bcl-2和Bax基因表达的影响。方法采用线栓法建立大鼠脑缺血模型；尼莫地平预处理；逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定其海马组织中Bcl-2和Bax mRNA。结果大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)后，海马组织Bcl-2和Bax基因均被诱导表达，Bcl-2表达量持续升高，而Bax表达量在脑缺血24h达高峰，随后逐渐下降。在脑缺血后6h和24h，经尼莫地平预处理7d的大鼠，海马组织Bcl-2基因的表达水平较未经预处理的大鼠明显上调，而Bax基因表达水平则较未经预处理的大鼠明显下调。结论钙拮抗剂尼莫地平能有效地调控大鼠缺血性脑损伤后海马组织Bcl-2和Bax基因表达的水平，为干预脑卒中后基因表达提供依据。     

高剂量灵芝孢子粉干预戊四氮致痫模型大鼠海马及皮质区神经细胞Bcl-2、Bax的表达

采用中药灵芝孢子粉低、中、高剂量（150, 300, 450 mg/kg）干预戊四氮致癫痫模型28 d，并设空白对照组。经免疫组织化学染色和TUNEL检测后发现，与模型相比，灵芝孢子粉高剂量组大鼠海马和皮质区神经细胞TUNEL阳性细胞数及Bax阳性细胞数均减少，而Bcl-2阳性表达细胞数增加。Morris水迷宫实验检测结果显示，灵芝孢子粉高剂量组大鼠逃避潜伏期缩短，跨过原平台次数增加。说明高剂量灵芝孢子粉上调癫痫模型大鼠海马和皮质区神经细胞Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax免疫反应及癫痫所致的神经细胞凋亡，明显改善其学习记忆功能。     

Is the Cell Death in Mesial Temporal Sclerosis Apoptotic?

PURPOSE: Mesial temporal sclerosis (MTS) is characterized by neuronal loss in the hippocampus. Studies on experimental models and patients with intractable epilepsy suggest that apoptosis may be involved in neuronal death induced by recurrent seizures. METHODS: We searched evidence for apoptotic cell death in temporal lobes resected from drug-resistant epilepsy patients with MTS by using the terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) and digoxigenin-11-dUTP (TUNEL) method and immunohistochemistry for Bcl-2, Bax, and caspase-cleaved actin fragment, fractin. The temporal lobe specimens were obtained from 15 patients (six women and nine men; mean age, 29 +/- 8 years). RESULTS: Unlike that in normal adult brain, we observed Bcl-2 immunoreactivity in some of the remaining neurons dispersed throughout the hippocampus proper as well as in most of the reactive astroglia. Bax immunopositivity was increased in almost all neurons. Fractin immunostaining, an indicator of caspase activity, was detected in approximately 10% of these neurons. Despite increased Bax expression and activation of caspases, we could not find evidence for DNA fragmentation by TUNEL staining. We also could not detect typical apoptotic changes in nuclear morphology by Hoechst-33258 or hematoxylin counterstaining. CONCLUSIONS: These data suggest that either apoptosis is not involved in cell loss in MTS, or a very slow rate of cell demise may have precluded detecting TUNEL-positive neurons dying through apoptosis. Increased Bax expression and activation of caspases support the latter possibility.     

雌激素调控瞬时外向钾通道对大鼠慢性颞叶癫发作的影响

目的探讨雌激素对大鼠慢性颞叶癫发作的影响及其与瞬时外向钾通道(kv4.2)之间的关系。方法 SD雌性大鼠随机分为正常对照组、去势对照组、正常致组、去势致组。应用毛果芸香碱诱导大鼠癫持续状态(SE),观察大鼠行为学变化。经4周后成为慢性颞叶癫大鼠。Western bolt方法检测大鼠海马瞬时外向钾通道Kv4.2蛋白表达水平。结果与正常致组比较,去势致组达到SE的潜伏期延长、死亡率降低,但差异无统计学意义(P0.05);去势致组的癫发作强度较正常致组轻,差异有统计学意义(P0.05)。去势致组和正常致组在SE 4周后海马Kv4.2均较正常对照组显著升高,均差异有统计学意义(P0.05和P0.01)。去势对照组和去势致组比较,均未见对Kv4.2蛋白表达产生影响,说明Kv4.2蛋白表达升高为癫发作所致。结论大鼠癫发作后Kv4.2表达增加、瞬时外向钾电流增强、神经冲动的发放频率减慢,可能是产生代偿性自我保护反应的结果;虽然去势雌性大鼠未对Kv4.2表达产生影响,但出现潜伏期延长和死亡率降低、发作强度降低的行为学趋势,提示低剂量雌激素可能存在对癫发作的保护作用。     

Effects of TRPV1 on the hippocampal synaptic plasticity in the epileptic rat brain

Temporal lobe epilepsy is often presented by medically intractable recurrent seizures due to dysfunction of temporal lobe structures, mostly the temporomesial structures. The role of transient receptor potential vaniloid 1 (TRPV1) activity on synaptic plasticity of the epileptic brain tissues was investigated. We studied hippocampal TRPV1 protein content and distribution in the hippocampus of epileptic rats. Furthermore, the effects of pharmacologic modulation of TRPV1 receptors on field excitatory postsynaptic potentials have been analyzed after induction of long term potentiation (LTP) in the hippocampal CA1 and CA3 areas after 1 day (acute phase) and 3 months (chronic phase) of pilocarpine‐induced status epilepticus (SE). A higher expression of TRPV1 protein in the hippocampus as well as a higher distribution of this channel in CA1 and CA3 areas in both acute and chronic phases of pilocarpine‐induced SE was observed. Activation of TRPV1 using capsaicin (1 µM) enhanced LTP induction in CA1 region in non‐epileptic rats. Inhibition of TRPV1 by capsazepine (10 µM) did not affect LTP induction in non‐epileptic rats. In acute phase of SE, activation of TRPV1 enhanced LTP in both CA1 and CA3 areas but TRPV1 inhibition did not affect LTP. In chronic phase of SE, application of TRPV1 antagonist enhanced LTP induction in CA1 and CA3 regions but TRPV1 activation had no effect on LTP. These findings indicate that a higher expression of TRPV1 in epileptic conditions is accompanied by a functional impact on the synaptic plasticity in the hippocampus. This suggests TRPV1 as a potential target in treatment of seizure attacks. Synapse 69:375–383, 2015. © 2015 Wiley Periodicals, Inc.     

人参皂甙Rd对颞叶癫大鼠学习记忆能力及海马5-HT表达的影响

目的研究人参皂甙Rd对氯化锂-匹罗卡品点燃颞叶癫(temporal lobe epilepsy,TLE)大鼠学习记忆能力及海马5-HT表达的干预作用。方法建立氯化锂-匹罗卡品点燃颞叶癫大鼠模型,将30只造模成功的颞叶癫大鼠随机分为TLE组(生理盐水10ml/kg腹腔注射,15只)及GSRd干预组(人参皂甙Rd2mg/kg腹腔注射,15只),另选15只大鼠作为正常对照组;采用Morris水迷宫及免疫组化染色分别检测各组大鼠学习记忆能力及海马5-HT表达水平。结果与正常对照组比较,TLE组大鼠学习记忆能力下降,海马5-HT表达明显减少(P0.05);与TLE组比较,GSRd干预组可显著提高大鼠学习记忆能力及海马5-HT的表达水平(P0.05)。结论人参皂甙Rd可能通过增加海马5-HT的表达来提高颞叶癫大鼠学习记忆能力。     

阿魏酸对戊四氮致癫痫大鼠海马组织中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

目的探讨阿魏酸(Ferulic acid,FA)对戊四氮致癫痫大鼠海马组织中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响,近而讨论FA对戊四氮致癫痫鼠海马神经元的保护作用。方法将60只雄性健康的Wister大鼠随机分为生理盐水组、模型组(PTZ 35 mg/kg)和阿魏酸干预组(50 mg/kg),均采用腹腔注射的方式,连续注射28 d,停止给药1 d后处死实验大鼠、取材。应用免疫组织化学技术和Western blot方法来检测Bax和Bcl-2的表达情况,用来判断癫痫所导致的细胞凋亡情况。结果阿魏酸干预组大鼠的海马组织Bax的表达量明显低于模型组,差异有显著性(P0.01),Bcl-2的表达量高于模型组,差异有显著性(P0.01);生理盐水组大鼠的海马组织内Bax的表达量明显低于模型组,差异有显著性(P0.01),Bcl-2表达量明显高于模型组,差异有显著性(P0.01)。结论阿魏酸对戊四氮致癫痫大鼠海马神经元损伤具有保护作用,其保护作用机制可能与其抑制鼠脑细胞凋亡有关。