GCS通过影响凋亡相关基因致白血病细胞耐药的分子病理机制探讨

目的 通过研究苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(PPMP)和小干扰RNA(siRNA)对白血病多药耐药细胞K562/AO2葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基闪的调节及对凋亡相关基因的影响,以探讨GCS基因致白血病多药耐药的分子病理机制.方法 应用体外细胞培养技术和RNA干扰技术观察GCS特异性的化学抑制剂PPMP及针对GCS的siRNA对K562/AO2细胞GCS基因的抑制作用,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析GCS基因被抑制前后K562/AO2细胞中GCS摹因、Bcl-2基因、Bax基因的表达水平及差异.结果 PPMP和siRNA可抑制K562/AO2细胞GCS mRNA的表达,同时致相应细胞的Bcl-2基因表达下降,Bax基因则无明显变化.结论 GCS可能是通过Bcl-2信号转导途径使细胞的抗凋亡能力增强,从而导致白血病细胞的多药耐药.     

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株K562/AO2中的表达及其与白血病多药耐药的关系

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶（GCS）基因在人红白血病多药耐药细胞株K562/AO2的表达及其与肿瘤多药耐药性（MDR）的关系。方法运用Alamar Blue^TM多功能细胞染色法证实K562/AO2的多药耐药性;采用RT-PCR技术检测K562/AO2及其亲本K562细胞株的GCS基因、MDR1基因、bcl-2基因、bax基因的表达水平及其差异。结果（1）阿霉素（ADR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为75μg/ml和0.65μg/ml,耐药指数为115;长春新碱（VCR）对K562/AO2细胞和K562细胞的IC50分别为8μg/ml和0.22μg/ml,耐药指数为36。（2）K562/AO2细胞GCS基因和MDR1基因的表达明显强于K562细胞;K562/AO2细胞bcl-2基因表达强于K562细胞,而bax基因表达弱于K562细胞。结论GCS基因可能在白血病多药耐药中起着重要的作用,而细胞凋亡基因的表达异常可能是它导致肿瘤多药耐药的主要分子病理机制之一。     

环孢菌素A、汉防己甲素及两者联合逆转K562/A02 细胞的多药耐药

目的:探讨环孢菌素A(CsA)、汉防己甲素(Tet)及两者联合应用对人白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药的逆转作用。方法:采用MTT法测定柔红霉素(DNR)对细胞的半数抑制量(IC50),流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内DNR浓度。结果:DNR对K562细胞和K562/A02细胞IC50分别为0.27和21.22 mg.L-1;CsA(1 mg.L-1)及Tet(0.1 mg.L-1)单独和联合处理K562/A02后,DNR的IC50分别为7.83、5.32和2.32 mg.L-1;CsA和Tet对DNR作用K562的IC50无明显影响;K562/A02细胞48 h凋亡率为2.19%,DNR(1 mg.L-1)作用K562/A02细胞凋亡率为2.70%,CsA和Tet单独及联合处理后凋亡率分别为10.27%、17.64%和52.79%;两药处理后细胞内化疗药物DNR浓度亦明显增加。结论:CsA及Tet均可逆转耐药,且联合作用逆转效果更强。     

环孢素A对K562/DOX细胞药物积累和外排的影响

目的 研究环孢素A(cyclosporin A,CsA)对K562/DOX细胞多药耐药的逆转作用.方法 以 CsA作为耐药逆转剂,用MTT法和流式细胞仪观察CsA对多药耐药白血病细胞株K562/DOX的药物敏感性、细胞内药物积聚和外排的影响.结果 CsA能剂量相关性地增加阿霉素(doxorubicin,DOX)K562/DOX细胞内的累积,明显抑制P-gp介导的DOX外排,显著增强阿霉素对K562/DOX细胞的细胞毒作用.但对K562细胞药物敏感性、细胞内药物外排和积聚均无影响.结论 CsA能有效地减慢K562/DOX细胞内DOX外排速度,增加细胞内DOX积聚.     

苦参碱逆转人白血病K562/ADM细胞对阿霉素耐药性的研究

[目的] 探讨苦参碱对人白血病K562／ADM细胞对阿霉素耐药性的逆转作用。[方法] MTT法测定苦参碱的细胞毒性及其对K562／ADM细胞药敏性的影响,荧光分光光度法检测细胞内药物浓度的改变,流式细胞术检测耐药细胞凋亡百分率的变化。[结果] 苦参碱的非细胞毒性剂量为50μg／mL,低细胞毒性剂量为125μg／mL。50μg／mL苦参碱可增加K562／ADM细胞内阿霉素(ADM)浓度和K562／ADM细胞凋亡百分率,使K562／ADM细胞的IC50由原来的35．2μg／mL降低至15．8μg／mL,其逆转倍数为2．2倍。[结论] 苦参碱可部分逆转人白血病K562／ADM细胞对阿霉素的耐药性,其逆转机制与增加细胞内药物积累有关。     

普乐林对K562、K562/AO2的增殖抑制和耐药逆转作用

目的 研究黄酮类化合物普乐林(Puerarin)对K562和K562/AO2细胞增殖抑制、药物增敏、耐药逆转的作用.方法 台盼蓝拒染试验、MTT实验检测Puerarin对K562、K562/AO2的抑制作用;MTT实验检测阿霉素单独和与Puerarin合用对K562、K562/AO2的半数抑制浓度.结果 3.2μmol/L的Puerarin即对K562、K562/AO2有生长抑制作用,其最大抑制浓度为25.0μmol/L,Puerarin对两种细胞的抑制差异无统计学意义(P＞0.05);阿霉素对K562细胞的IC50为0.131μg/mL,对K562/AO2的IC50为7.542μg/mL,耐药倍数为57.14倍;Puerarin加大了阿霉素对K562的杀伤敏感性(最大增敏倍数1.42),同时能部分逆转K562/AO2对阿霉素的耐药性(最大相对逆转效率91%).结论 Puerarin对K562、K562/AO2细胞的增殖抑制作用有限;但Puerarin具有较明显逆转K562/AO2对阿霉素的耐药作用.     

川芎嗪对转基因多药耐药细胞K562/MDR耐药性的逆转作用

目的：研究川芎嗪（TMP）与环孢菌素A（CsA）单独及联合逆转人红白血病多药耐药细胞K562/MDR的多药耐药性（MDR）,并进一步探讨其耐药逆转机制。方法：分别以倍比稀释后不同浓度的TMP（50～6　400 mg?L^-1 ）和CsA（0.5～256 mg·L^-1 ）作用于体外培养的K562/MDR细胞72 h,采用MTT法检测细胞生长率,确定TMP和CsA的非细胞毒性剂量;采用非细胞毒性剂量,实验分为5组：G1组（TMP+ADM+K562/MDR）、G2组（CsA+ADM+K562/MDR）、G3组（TMP+CsA+ADM+K562/MDR）、阴性对照组（以K562/S代替K562/MDR）、空白对照组（以1640培养基代替药物）,检测各组细胞生长抑制50%的ADM浓度,即IC₅₀,计算耐药倍数和逆转倍数;利用荧光分光光度法检测各组细胞内ADM浓度;流式细胞术检测跨膜糖蛋白P-gp的表达情况。结果：TMP及CsA的非细胞毒性剂量分别为320和2.0 mg·L^-1,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA均能降低K562/MDR细胞的耐药性,逆转倍数分别为5.2及9.6倍,并且两者联合应用,逆转倍数为15.6倍;TMP和CsA单独及联合应用均能明显增加K562/MDR细胞内ADM浓度;TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,并且两者联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显降低,与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01)。结论：TMP和CsA单独及联合应用可逆转K562/MDR细胞对化疗药物ADM的MDR,且两者具有协同作用。其逆转机制可能为降低P-gp水平,升高细胞内ADM浓度,增强对ADM的敏感性,从而发挥治疗肿瘤的作用。     

环氧合酶-2抑制剂联合苦参碱逆转K562/AO2细胞多药耐药的研究

目的:研究塞来昔布单独及联合应用苦参碱对K562/AO2细胞多药耐药逆转作用的影响,以及探讨他们互相作用的机理.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测阿霉素(ADM)的半数抑制量;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR方法检测多药耐药基因(MDR)和环氧合酶-2(COX-2)mRNA的表达水平;Western blotting方法检测人p-糖蛋白(P-gp)和COX-2蛋白的表达水平.结果:ADM对K562、K562/AO2细胞的IC50值分别为0.398、33.31 μg·ml-1;苦参碱(200 μg·ml-1)、塞来昔布(7.5 μg·ml-1)单独及联合应用处理细胞时,ADM对K562/AO2细胞的IC50值分别为9.44、12.84、2.71 μg·ml-1;苦参碱、塞来昔布单独及联合应用于K562/AO2细胞后凋亡率明显增加,MDR1和COX-2 mRNA以及P-gp、COX-2蛋白的表达明显下调,且两药联合时下调更明显.结论:苦参碱和塞来昔布均有逆转K562/AO2细胞多药耐药的作用,两药联合应用时效果更加明显,P-gp的高表达可能与COX-2的表达上调有关.     

环孢菌素A、汉防己甲素及两者联合逆转K562／A02细胞的多药耐药

目的：探讨环孢菌素A（CsA）、汉防己甲素（Tet）及两者联合应用对人白血病耐药细胞系K562／A02多药耐药的逆转作用。方法：采用M1Tr法测定柔红霉素（DNR）对细胞的半数抑制量（IC50），流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内DNR浓度。结果：DNR对K562细胞和K562／A02细胞IC50分别为0．27和21．22mg·L^-1；CsA（1mg·L^-1）及Tet（0．1mg·L^-1）单独和联合处理K562／A02后，DNR的IC50分别为7．83、5．32和2．32mg·L^-1；CsA和Tet对DNR作用K562的IC50无明显影响；K562／A02细胞48h凋亡率为2．19％，DNR（1mg·L^-1）作用K562／A02细胞凋亡率为2．70％，CsA和Tet单独及联合处理后凋亡率分别为10．27％、17．64％和52．79％；两药处理后细胞内化疗药物DNR浓度亦明显增加。结论：CsA及Tet均可逆转耐药，且联合作用逆转效果更强。     

Bcl-2参与的抗凋亡机制在白血病耐药中的作用

目的:肿瘤多药耐药(multi-drug resistance,MDR)是目前肿瘤研究的难点及热点领域.本研究以人慢性粒细胞白血病细胞株K562和阿霉素(ADR)耐药细胞株K562/AO2为研究对象,观察两细胞株在ADR作用下Bcl-2的表达水平,借此探讨其参与的抗凋亡机制在白血病多药耐药中的作用.方法:MTT法测定K562和K562/AO2在ADR作用后的细胞活力(A值);DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡情况;FCM法测定细胞凋亡率、细胞周期及Bcl-2蛋白的表达.结果:MTT法测得ADR作用的K562细胞存活数下降,1.00μmol/LADR作用48h的K562细胞株A值最低,为0.803±0.032.DNA琼脂糖凝胶电泳及FCM法均显示ADR作用的K562细胞株有凋亡发生.FCM的结果表明,ADR作用的K562细胞株Bcl-2的阳性表达率低,1.00μmol/L ADR作用48 h的Bcl-2阳性表达率是(38.67±0.45)%.结论:耐药的主要机制是通过抑制细胞的凋亡途径完成,bcl-2是凋亡的主要调控基因,是一种耐药基因.     

PDTC逆转K562/AO2细胞多药耐药性机制研究

目的研究核因子κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）逆转K562/AO2细胞耐药效应及其机制。方法采用MTT比色法分别检测K562/AO2细胞的耐药性、PDTC对K562/AO2细胞增殖的影响以及非细胞毒剂量PDTC、维拉帕米（Ver）预作用后K562/AO2细胞药物敏感性的变化,采用免疫细胞组织化学法、RT-PCR检测K562、K562/AO2细胞NF-κB、mdr-1 mRNA表达水平以及PDTC作用一定时间对其影响。结果①K562/AO2细胞对阿霉素（ADM）的耐药性是K562细胞的59倍;非细胞毒剂量PDTC预作用后,ADM对K562/AO2细胞的半数抑制浓度（IC50）显著降低,相对逆转耐药效率为93.03%,强于经典耐药逆转剂Ver的作用81.07%（P〈0.01）;②K562/AO2细胞NF-κB表达水平高于K562细胞（P〈0.01）;PDTC可有效抑制K562/AO2细胞NF-κB表达,伴随mdr-1 mRNA表达减少,呈时间依赖性。结论抑制NF-κB异常活化可部分逆转K562/AO细胞耐药性,其机制与mdr-1 mRNA转录表达减少有关。     

甲孕酮联合苦参碱对耐药细胞株K562/AO2多药耐药逆转作用的研究

目的应用甲孕酮(MPA)联合苦参碱(MAT)逆转人白血病细胞株K562/AO2对阿霉素的耐药性,观察联合用药逆转耐药的疗效。方法用MTT法检测MPA与MAT的细胞毒性,荧光分光光度法检测各组细胞内药物(ADM)浓度的改变,流式细胞仪测定细胞凋亡的情况,流式细胞术检测细胞的p-gp表达情况。结果(1)确定了甲孕酮及苦参碱对K562/AO2细胞的非细胞毒性剂量和低细胞毒性剂量,确定了非细胞毒性剂量的两药联合应用后未出现毒性叠加。(2)在与ADM合用时,K562/AO2+甲孕酮及K562/AO2+苦参碱组,细胞凋亡百分率均高于K562/AO2耐药组(P<0.05,P<0.01),但均低于K562/AO2+甲孕酮+苦参碱组(P<0.01,P<0.05)。(3)与K562比较,K562/AO2细胞中P-gP呈高表达;与K562/AO2耐药组比较,K562/AO2十苦参碱组及K562/AO2+甲孕酮组P-gp表达量降低(P<0.01),但当两者联合应用时作用大于两者单独作用。(4)与ADM组比较苦参碱、甲孕酮均能提高K562/AO2细胞内ADM浓度,P均<0.01,两者联合应用时作用大于两者单独作用。结论非细胞毒性剂量的...     

甲孕酮对K562/AO2细胞及P-gp、Bcl-2耐药蛋白表达的影响

目的：探讨甲孕酮对白血病 K562/ AO2细胞凋亡率及 P - gp、Bcl -2耐药蛋白表达的影响。方法以 MTT法检测肿瘤细胞增殖的抑制率，流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡、P - gp 及 Bcl -2表达。结果甲孕酮能够提高 K562/AO2细胞的凋亡，能够下调 K562/ AO2细胞 P - gp、Bcl -2的表达。结论甲孕酮能提高 K562/ AO2细胞化疗敏感性，促进其凋亡，对 K562/ AO2细胞有一定的逆转耐药作用。     

环孢菌素A与细胞因子联合逆转白血病多药耐药性的体外研究

目的 探讨环孢菌素Ａ（ＣｓＡ）联合细胞因子对耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２的逆转作用,方法 以甲基四唑蓝法测定柔红霉素（ＤＮＲ）的细胞毒性,用流式细胞仪技术测定细胞内罗丹明（Ｒｈ１２３）浓度,用ＲＴ－ＰＣＲ及ＪＳＢ－１抗体分别检测多药耐药（ＭＤＲ１）ｍＲＮＡ及其Ｐ糖蛋白的表达。结果 １μｍｏｌ／ＬＣｓＡ,５００Ｕ／ｍｌ干扰素２００Ｕ／ｍｌ白介素２（ＩＬ－２）均能增加ＤＮＲ对耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２的     

环孢菌素A诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的：观察环孢菌素A对K562细胞株凋亡的影响及其作用机制。方法：采用瑞氏染色、流式细胞术观察环孢菌素A对K562细胞株凋亡的影响;采用流式细胞仪检测环孢菌素A影响K562细胞凋亡时Bcl-2基因表达的改变情况。结果：20μmol/L环孢菌素A作用24 h可诱导K562细胞凋亡,瑞氏染色呈现典型的凋亡形态学改变,流式细胞术显示凋亡峰,细胞周期分析发现环孢菌素A可使K562细胞生长阻滞于G0~G1期。环孢菌素A处理组的凋亡率高于对照组（P〈0.01）;环孢菌素A处理组的Bcl-2蛋白阳性率低于对照组（P〈0.01）。结论：环孢菌素A可诱导K562细胞株凋亡,其机制可能是通过下调Bcl-2基因表达。     

不同血液肿瘤细胞株survivin基因和蛋白表达及意义的研究

目的：研究survivin在不同血液肿瘤细胞株(Jurkat, Raji, EL 4, K562, K562/AO2)的表达，并探讨其与相关因素的关系。方法：应用RT PCR技术检测survivin mRNA在各细胞株的表达，用免疫组化法检测survivin 蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞周期。结果：survivin mRNA在4种人源性细胞株(Jurkat, Raji, K562, K562/AO2)中均有表达，耐药株K562/AO2高于其他细胞株；免疫组化结果显示survivin蛋白在胞核与胞浆均有表达，且表达水平与mRNA水平一致；细胞周期结果显示，survivin表达较高的细胞株G2/M期细胞比例和增殖指数较高。结论：survivin基因在血液肿瘤细胞株中普遍表达，survivin 高表达可能与肿瘤细胞增殖及耐药有关。     

Puerarin逆转K562/AO2耐药的分子机制

目的:研究黄酮类化合物puerarin对K562/A02(人红白血病多药耐药细胞系)细胞耐药逆转作用的分子机制.方法:免疫荧光染色方法检测阿霉素(ADR)和puerarin对K562(人红白血病细胞系)和K562/A02两种细胞NF-кB活性的影响;免疫细胞化学染色方法检测ADR和puerarin对K562和K562/A02的survivin表达的影响;流式细胞仪检测ADR和puerarin对K562和K562/A02的P-gP表达的影响.结果:经ADR处理后的K562细胞和K562/A02细胞NF-кB的活性明显高于K562细胞空白对照组;经puerarin预处理后再加ADR处理的K562细胞中的NF-кB的活性明显低于只用ADR处理的K562细胞.经puerarin干预后的K562/A02细胞的NF-кB的活性明显低于未经puerarin干预的K562/A02细胞;经ADR处理后的K562细胞和K562/A02细胞的p-gP,survivin表达明显高于K562细胞空白对照组;经puerarin预处理后再加ADR处理的K562细胞中的p-gp,survivin表达明显低于未经pu-erarin预处理的K562细胞;经puerarin干预后的K562/A02细胞的p-gp,survivin表达明显低于未经puer-arin干预的K562/A02细胞.p-gp和survivin表达呈正相关.结论:NF-кB的活化使p-gp和survivin表达增多可能是K562细胞多药耐药形成的机制之一.Puerarin能预防和阻止K562细胞耐药形成,并能逆转K562/A02对ADR的耐药,其机制与抑制NF-кB活性及survivin和p-gp的表达有关.