RNA干扰HIF-1α对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的VEGF表达及增殖的影响

目的 探讨shRNA特异性干扰沉默缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）的血管内皮生长因子（VEGF）表达及其增殖的影响.方法 获取9例RA患者滑膜组织进行RA-FLS的分离培养及传代.将FLS分为4组：常氧组、缺氧组、阴性质粒组（转染阴性质粒）和阳性质粒组（转染HIF-1α阳性质粒）,常氧组进行常规培养,后3组进行缺氧培养12h;采用Western blot和qRT-PCR法分别检测各组FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达情况.将缺氧组、阴性质粒组和阳性质粒组的FLS分别于缺氧条件下培养6、12、24、48h,应用MTT比色法检测各组细胞增殖情况.结果 与常氧组相比,缺氧组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达明显升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而阴性质粒组和缺氧组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达水平无明显差异（P＞0.05）;阳性质粒组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA较缺氧组下调,差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）.4组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表达呈正相关（P＜0.01）.缺氧培养12h后阳性质粒组的FLS生长较缺氧对照组及阴性质粒组减慢,差异有统计学意义（P＜0.05）,而后两组FLS生长无统计学差异（P＞0.05）.结论 RNA干扰HIF-1α表达能有效下调RA-FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA水平,并且能抑制FLS的异常增殖.     

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞糖酵解相关基因表达的影响

目的:探讨常氧及缺氧培养对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及糖酵解相关基因表达的影响?方法:选择3组细胞分别为食管鳞癌Eca-109细胞稳定转染HIF-1α siRNA及空质粒的Eca-109细胞,予以常氧和缺氧培养,缺氧培养时间分别为6?12?24?48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白表达,Western blot和RT-PCR检测3组细胞常氧和缺氧条件下糖酵解相关基因(Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ)的表达,分光光度法分别测定3组细胞常氧和缺氧培养下胞液中乳酸脱氢酶(LDH)?己糖激酶(HK)酶活性?结果:Eca-109细胞缺氧条件下培养,HIF-1α蛋白表达较常氧时增高,干扰细胞常氧下HIF-1α几乎无表达,缺氧后亦无增强?常氧和缺氧条件下,干扰细胞Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ mRNA和蛋白表达较未干扰细胞明显减弱(P < 0.05),干扰细胞胞液LDH?HK活性较未干扰细胞明显减少(P < 0.05)?结论:RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达,进而不同程度减少Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ糖酵解相关基因的表达?     

缺氧时乳腺癌细胞HIF-1α与CXCR4表达及迁移调控的实验研究

目的探讨缺氧时乳腺癌细胞缺氧诱导因子HIF-1α(HIF-1α)与趋化因子4(CXCR4)的表达及其对乳腺癌细胞迁移调控的影响。方法将MDA-MB-231乳腺癌细胞置入缺氧盒中,建立3%缺氧微环境,设为缺氧24 h组及缺氧48 h组,对照组为正常培养的乳腺癌细胞;采用MTT法测定乳腺癌细胞的增殖能力,RT-PCR法检测HIF-1α与CXCR4mRNA表达量,同时检测添加维生素C(Vit C)后HIF-1α与CXCR4mRNA的mRNA表达水平:Transwell小室测定各组细胞的迁移能力。结果与对照组比较,缺氧24、48 h组细胞增殖能力明显增加;缺氧24h组、缺氧48 h组HIF-1α、CXCR4 mRNA表达和细胞的迁移能力明显高于对照组(P<0.05);缺氧24 h+Vit C组、缺氧48 h+Vit C组HIF-1α、CXCR4 mRNA表达和细胞的迁移能力与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧能增加细胞的增殖能力,能增加乳腺癌细胞HIF-1α、CXCR4mRNA表达和迁移能力,但能被抗氧化剂Vit C有效阻断,提示HIF-1α可望成为抑制乳腺癌转移的治疗靶点。     

HIF-1信号通路在介导DMOG动员MSCs中的作用

目的探讨HIF-1及下游SDF-1α/CXCR4和VEGF/VEGFR通路在介导DMOG动员MSCs中的作用机制。方法将雄性SD大鼠,随机分为五组:生理盐水对照组、DMOG组、YC-1组、AMD3100组、SU5416组。分别采用CFU-F法与流式细胞术检测大鼠骨髓和外周血中MSCs的数量;ELISA法检测骨髓上清及外周血清中SDF-1α及VEGF蛋白浓度;Western blotting法检测骨髓细胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表达水平。结果同NS组比较,DMOG组CFU-Fs数量显著增加,且CD45-CD90+细胞群比例增加(P<0.05);同DMOG组比较,YC-1组、AMD3100组、SU5416组CFU-Fs数量均显著减少,且CD45-CD90+细胞群比例降低(P<0.05);同DMOG组比较,YC-1组HIF-1α浓度及蛋白表达显著降低(P<0.05),AMD3100组SDF-1α浓度及蛋白表达显著降低(P<0.05),SU5416组VEGF浓度及蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 DMOG可能通过上调HIF-1α,从而调控其下游SDF-1α/CXCR4通路与VEGF/VEGFR通路诱导MSCs的动员。     

体外培养大鼠视网膜神经节细胞缺氧条件下HIF-1α动态表达及意义

目的探讨体外培养Long Evans大鼠视网膜神经节细胞缺氧条件下缺氧诱导因子1α（hypoxia induction factor 1α,HIF-1α）表达变化及损伤机制。方法正常对照组视网膜神经节细胞在常规条件下、缺氧组在1％氧浓度下分别培养1、3、12、24h。采用RT—PCR法检测神经节细胞HIF-1α mRNA水平,蛋白质免疫印迹法测定HIF-1α蛋白水平表达,免疫荧光法进行HIF-1α细胞内定位检测,分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代戊巴比妥酸法、酶标双抗夹心免疫吸附法ELISA方法测定培养液SOD活性、MDA含量及TNFoa水平检测。结果正常对照组神经节细胞未见HIF-1α mRNA及蛋白表达,缺氧组HIF-1α mRNA水平、蛋白表达随缺氧时间延长显著升高（P〈0．01）,其峰值分别在缺氧后3h和12h。免疫荧光法见缺氧组HIF-1α表达于神经节细胞胞浆。缺氧组细胞培养液SPD活性随缺氧时间时间延长显著降低,MDA含量及TNF-α含量显著升高,差异有统计学意义（P〈0．05、P〈0．01）。结论体外培养视网膜神经节细胞在缺氧条件下其HIF-1α mRNA水平及蛋白表达呈上升后降低趋势,其表达变化与缺氧时培养液中脂质过氧化反应逐渐增强、抗氧化能力降低及炎性因子水平上升有关。     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子1α对乏氧条件下食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子（HIF）-1α对食管鳞癌EC9706细胞乏氧条件下化疗敏感性的影响及其机制。方法应用化学乏氧法[氯化钴（CoCl2）加入培养液的终浓度为75μmol／L]体外模拟肿瘤乏氧微环境。采用MTS比色法检测常氧培养组和乏氧培养组EC9706细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率,以及RNA干扰后乏氧培养细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。应用Western印迹方法检测HIF-1α基因沉默后乏氧诱导HIF-1α蛋白表达变化。用流式细胞仪检测RNA干扰前后乏氧条件下EC9706细胞的细胞周期。结果针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,有效抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。同一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均明显高于乏氧培养组（均P〈0．05）。相同药物浓度及相同的乏氧条件下RNA干扰组抑制率均明显高于未转染组及转染control siRNA组（均P〈0.05）。相同的乏氧条件下转染HIF-1α siRNA与未转染组／转染无关对照siRNA组相比,S期显著增加（P〈0．05）、G1期细胞减少（P〈0．05）。结论乏氧条件下HIF-1α诱导EC9706细胞周期停止,可能是乏氧条件下细胞耐药的机制之一。RNA干扰可逆转食管癌细胞EC9706乏氧环境中化疗耐药。     

缺氧应激对HepG-2增殖活性和HIF-1α、MMP-2表达的影响

目的研究缺氧应激对人肝癌细胞HepG-2增殖和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、基质金属蛋白-2(MMP-2)表达的影响。方法将缺氧(5%O2、5%CO2、90%N2)和常氧环境中培养的HepG-2细胞,在相差显微镜下观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定常氧组和缺氧4、12、24h组HepG-2细胞HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA的表达量;用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定常氧和缺氧12、24h组细胞培养上清MMP-2蛋白含量。结果同时相缺氧组HepG-2细胞增殖活性与常氧组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。常氧下HepG-2细胞不表达HIF-1αmRNA,缺氧4h时HIF-1αmRNA表达量最高,随后下降(P<0.01),但仍高于常氧组;缺氧4h时MMP-2mRNA表达量最高,随后下降,但仍高于常氧组(P<0.01);缺氧组HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA呈高度正相关关系。缺氧24h组HepG-2细胞培养上清液中的MMP-2蛋白含量与常氧24h组含量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧应激(5%O2)促进人肝癌细胞HepG-2的增殖作用并上调HIF-1α和MMP-2的表达量。     

沉默缺氧诱导因子对人胶质瘤SHG44细胞糖酵解及细胞增殖的影响

目的探讨沉默缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)对缺氧状态人胶质瘤SHG44细胞糖酵解及细胞增殖的影响及机制。方法用氯化钴(CoCl2)模拟缺氧,并应用小分子RNA干扰(siRNA)技术沉默HIF-1α基因表达。将细胞分成4组:正常培养组、缺氧培养组、阴性对照组和siRNA干扰组。各组又分为常糖组(2 g/L)和高糖组(5 g/L)。Real-time PCR、Western blot法分别检测肿瘤细胞HIF-1α和糖酵解酶的mRNA及蛋白表达;生物发光法检测细胞内ATP水平;激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位;MTT法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡、坏死及细胞内活性氧的变化。结果①缺氧条件下,HIF-1αsiRNA干扰沉默HIF-1α基因的效率达到71%。②缺氧培养组HIF-1α和糖酵解酶的mRNA和蛋白表达高于正常培养组(P<0.05),细胞内ATP水平减少、细胞坏死和凋亡均增加,而细胞增殖能力明显增强(P<0.05),同时线粒体膜电位升高(P<0.05)。③siRNA干扰组HIF-1α和糖酵解酶的表达量低于缺氧培养组、阴性对照组(P<0.05);ATP水平低于缺氧培养组,细胞增殖率下降(P<0.05),细胞坏死率高于缺氧培养组(P<0.05),线粒体膜电位恢复。结论缺氧诱使肿瘤细胞表达HIF-1α,促进肿瘤恶性进展;siRNA干扰沉默HIF-1α能加重缺氧状态下SHG44细胞的生长抑制和坏死,其机制与抑制糖酵解、恢复线粒体功能有关。     

HIF-1α和CXCR4蛋白在乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和趋化因子受体4（CXCR4）蛋白在乳腺癌组织中的表达及与临床病理因素的关系。方法采用免疫组化法检测60例乳腺癌、30例乳腺纤维腺瘤和20例正常乳腺组织中HIF-1α和CXCR4蛋白的表达，分析乳腺癌组织中HIF-1α和CXCR4蛋白表达之间及其与临床病理因素的关系。结果HIF-1α和CXCR4蛋白在正常乳腺组织中无阳性表达；在乳腺纤维腺瘤和乳腺癌组织中，HIF-1α蛋白的阳性表达率分别26．7％和65．0％（P〈0．05），CXCR4蛋白的阳性表达率分别为23．3％和56．7％（P〈0．01）。HIF-1α蛋白表达与淋巴结转移、肿瘤分期、组织学分级和血管内皮生长因子（VEGF）表达密切相关（P〈0．05），与年龄、肿瘤大小、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）表达无关；CXCR4蛋白表达与淋巴结转移、肿瘤分期以及VEGF、ER和PR表达密切相关（P〈0．05），与年龄、肿瘤大小和组织学分级无关。HIF-1α与CXCR4蛋白表达呈正相关（r=0．346，P=0．007）。结论HIF-1α和CXCR4蛋白在乳腺癌组织中的高表达与乳腺癌发生、发展及淋巴结转移密切相关。联合检测HIF-1α和CXCR4蛋白的表达，有利于评估乳腺癌的生物学行为，提高预后判断的准确性，并对临床治疗有重要的指导意义。     

缺氧诱导滋养细胞转化生长因子3β表达与调控

目的：探讨低氧对滋养细胞转化生长因子3B(TGF-3β)的表达的诱导作用，以及缺氧诱导因子1(HIF-1)对TGF-3β表达的调控作用．方法：滋养细胞来源的BeWo细胞系分4组培养：正常对照组、缺氧组、HIF—1α反义组和HIF-1α正义组．HIF-1α反义组和HIF-α正义组先加入HIF-1α寡核苷酸，常氧条件培养6h，再低氧条件培养48h．48h后，收集细胞，实时定量PCR方法检测TGF-3β和HIF-1α mRNA表达水平，Western blot方法检测TGF-3β和HIF-1α蛋白表达水平．结果：与正常对照组相比，缺氧组的HIF-1α mRNA和蛋白表达增加，TGF-3β mRNA和蛋白表达也升高；与HIF—1α 正义组比较，HIF-1α反义组HIF-1α mRNA和蛋白表达降低，TGF-3β mRNA和蛋白表达也下降．结论：缺氧可以诱导滋养细胞TGF-3β表达，并且缺氧对TGF-3β表达的诱导作用可能通过HIF-1调控．     

dn HIF-1α对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的 研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用.方法 将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较.结果 重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05).转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达.提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用.     

dn HIF-1对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用。方法将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较。结果重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05)。转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达。提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用。     

流式细胞术辅助筛选和纯化人缺氧诱导因子-1α基因沉默肝癌细胞株

目的利用流式细胞术（FCM）协助筛选、纯化RNA干扰（RNAi）效率高的人缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）基因沉默肝癌细胞株.方法选择带Neor及GFP基因的质粒pGenesil-1.1构建HIF-1α靶向小干扰RNA（siRNA）重组表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721.首先用G418筛选,然后用FCM检测出常氧、缺氧条件下HIF-1α蛋白表达抑制效率最高的转基因细胞株.根据FCM可分选GFP阳性细胞这一特点,进一步用流式细胞分选仪分选纯化转基因细胞,最后用PCR和免疫组化方法鉴定纯化细胞株的HIF-1α干扰效率.结果单用G418筛选HIF-1α干扰组细胞最高筛选效率为32.9%,FCM检测HIF-1α蛋白抑制率为78.7%～92.8%;合并使用G418和FCM分选纯化后,最佳HIF-1α干扰组筛选效率达94.4%,常氧、缺氧条件下对HIF-1αmRNA表达抑制率分别为95.5%、85.2%.结论合并使用G418及FCM分选纯化得到了高RNAi效率的人HIF-1α基因沉默肝癌细胞株,为进一步研究HIF-1α与肝癌关系及靶向HIF-1α的肝癌基因治疗提供了实验基础.     

基质细胞衍生因子-1α在颈总动脉球囊损伤后血管中的表达

目的观察基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)在颈总动脉球囊损伤后血管中的表达。方法60只雄性SD大鼠分成对照组(C组)和球囊损伤组(S组),后者又分为术后即刻组(S0组)和术后1 d、4 d、7 d组(S1、S4、S7组)。S组大鼠均行左侧颈总动脉球囊损伤术。各组大鼠分别采血,流式细胞仪检测外周血中CD34 CXCR4 细胞;取左侧颈总动脉,应用RT-PCR技术和Western blotting法分别检测SDF-1αmRNA和蛋白表达。结果S0、S1、S4组大鼠外周血中CD34 CXCR4 细胞显著增加(P<0.01),以S0组上升最明显,随后逐渐下降,S7组恢复至基础水平。S0、S1、S4、S7组大鼠颈总动脉样本均可见SDF-1αmRNA和蛋白表达,而C组颈总动脉样本则未见SDF-1αmRNA及其蛋白的表达。结论血管损伤后,SDF-1αmRNA和蛋白的表达显著增加,并伴随外周血中CD34 CXCR4 细胞数的增加。提示SDF-1α/CXCR4间的相互作用可能在血管损伤后的修复中发挥一定的作用。     

脯氨酸羟化酶抑制剂对小鼠间充质干细胞的动员作用

[目的]探讨脯氨酸羟化酶抑制剂---二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxaloylglycine,DMOG）对小鼠间充质干细胞（mouse mesenchymal stem cel s,mMSCs）的动员作用。[方法]ICR小鼠随机分为对照组及3个DMOG动员剂量组（20、40、80mg＆#183;kg-1）。不同剂量的DMOG每天一次在固定的时间段腹腔内注射入ICR小鼠,对照组给予相同体积的生理盐水。采用流式细胞术与成纤维细胞集落形成单位法检测不同浓度DMOG处理后小鼠外周血与骨髓中MSCs数量,Western blotting法检测骨髓细胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白的表达,ELISA法检测骨髓上清及外周血清中SDF-1α及VEGF蛋白的浓度。[结果]流式细胞术与成纤维细胞集落形成单位法检测发现不同剂量的DMOG处理7d后小鼠外周血与骨髓中MSCs数量较对照组显著增加（P＜0.05）,且CD45-CD90＋细胞群比例升高（P＜0.05）。同时Western blotting法及ELISA法检测发现小鼠骨髓HIF-1α、SDF-1α表达上调,VEGF浓度升高（P＜0.05）。[结论]DMOG对小鼠间充质干细胞具有动员作用,可能与通过上调HIF-1α,从而调控其下游相关通路有关。     

HIF-1αsiRNA重组腺病毒对缺氧肺微血管内皮细胞HIF-1α和ET-1表达的影响

目的研究缺氧诱导因子-1αsiRNA重组腺病毒(Ad/siHIF-1α)对缺氧肺微血管内皮细胞(RPMVECs)HIF-1α及其下游基因ET-1表达的影响。方法原代培养肺微血管内皮细胞(RPMVECs);应用HEK293细胞大量扩增Ad/siHIF-1α。将RPMVECs分6组:A组(正常对照:常氧下5%CO2、95%空气、37℃培养);B组(含100μmol/L COCl2培养基培养4h);C组(Ad/siHIF-1α感染24h后,加入COCl2培养4h);D组(Ad/siHIF-1α感染48h后,加入COCl2培养4h);E组(Ad/siHIF-1α感染72h后,加入COCl2继续培养4h);F组(单纯腺病毒感染72h后,加入COCl2培养4h)。采用荧光定量PCR法检测HIF-1α和ET-1mRNA表达;Western blotting法检测HIF-1α蛋白表达;ELISA法检测ET-1蛋白表达。结果与B组比较,C、D及E组HIF-1αmRNA、HIF-1α蛋白表达显著下调,差异有显著性(均P<0.05);与B组比较,C、D及E组ET-1mRNA、ET-1蛋白也相应下调,差异有显著性(均P<0.05)。...     

HIF-1α和CXCR4蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和趋化因子受体4（CXCR4）蛋白在胃癌组织中的表达及与胃癌临床病理因素的相关性。方法采用免疫组化sP法检测44例胃癌组织、44例相应癌旁组织（距癌组织边缘〉5cm）中HIF-1α和CXCR4蛋白的表达,分析胃癌组织中HIF-1α和CXCR4蛋白表达与胃癌临床病理因素的相关性,并分析HIF-1α和CXCR4蛋白表达之间是否相关。结果癌旁组织中HIF-1α和CXCR4蛋白均无表达,胃癌组织中HIF-1α和CXCR4蛋白阳性表达率分别为59．1％和63．6％,与癌旁组织比较差异均有统计学意义（P〈0．01）;HIF-1α蛋白表达与胃癌TNM分期和浸润深度相关（P〈0．01）,与是否淋巴结转移相关（P〈0．05）,与性别、年龄、肿瘤直径和分化程度无关;CXCR4蛋白表达与是否淋巴结转移相关（P〈0．01）,与TNM分期相关（P〈0．05）,与性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度和分化程度无关。胃癌组织中HIF-1α与CXCR4蛋白表达呈正相关（r=0．332,P=0．028）。结论HIF-1α和CXCR4蛋白表达可能与胃癌的发生有关,胃癌组织中HIF-1α和CXCR4蛋白的高表达预示胃癌恶性程度高,临床分期较晚,可能存在淋巴结转移。联合检测HIF-1α和CXCR4蛋白的表达,有利于评估胃癌的生物学行为,提高预后判断的准确性,并对临床治疗有重要指导意义。     

c-myc通过提高结肠癌细胞LoVo的HIF-1α表达促进血管生成

目的 研究癌基因c-myc对人结肠癌细胞LoVo中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响及其对血管生成的作用.方法 构建高表达c-myc的质粒pcDNA3.1-c-myc;将构建好的pcDNA3.1-c-myc质粒转染入LoVo细胞系中,通过Western blot检测c-myc在LoVo细胞中的表达情况.应用real-time PCR和Western blot检测常氧和乏氧状态下LoVo细胞系中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平及HIF-1α的蛋白水平.应用条件培养液培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察其形成血管的能力.结果 成功构建pcDNA3.1-c-myc质粒;常氧、乏氧状态下转染pcD-NA3.1-c-myc质粒后,LoVo细胞系中HIF-1α的mRNA水平无变化,VEGF的mRNA水平明显升高,HIF-1α蛋白水平明显增高.高表达c-myc的LoVo细胞上清液培养HUVECs细胞后能增强其成管能力.结论 在LoVo细胞系中高表达c-myc,可以促进细胞HIF-1α和其下游的VEGF表达,从而促进血管生成.     

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α（HIF-1α）促血管内皮祖细胞（EPCs）成血管活性的可行性。方法密度梯度法分离人外周血EPCs，电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPCs，RT-PCR法观察未转染／转染质粒在转染后3、12、20、72h，HIF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达含量的变化；免疫组化法检测常氧中转染前后HIF-1α蛋白表达、VEGF受体Flk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异；ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶（eNOS）含量的改变。结果HIF-1α基因有效转染入EPCs；HIF-1α mRNA在未转染时即有表达，在HIF-1α质粒转染后3、12、20、72h，含量较未转染时增加（P〈0．05）；HIF-1α过表达诱导VEGF表达上调（P〈0．05）。Flk一1蛋白在常氧下有一定含量，在HIF-1α质粒转染后Flk-1蛋白表达进一步增加。VEGF释放含量在HIF-1α过表达组显著增加（P〈0．05）；HIF-1α诱导eNOS含量增加，并与时间、VEGF刺激量成正比。结论HIF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs，促进其下游靶基因及受体表达，引起相应的功能学改变，促EPCs向内皮细胞分化、扩增，可进一步应用于基因治疗。     

乏氧对EC9706细胞多药耐药相关蛋白表达的影响

目的:研究乏氧对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株的多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)在乏氧引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法:采用化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)体外培养人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株,用RNAi沉默HIF-1α基因表达,应用半定量RT-PCR检测HIF-1α基因沉默效果.应用RT-PCR、免疫细胞化学技术检测RNA干扰前后乏氧条件下MRP1蛋白及RNA水平表达的变化.结果:乏氧后EC9706细胞中MRP1 mRNA和蛋白的表达均增加(P<0.05).针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,能有效沉默HIF-1α基因的表达.同样乏氧条件,转染HIF-1α siRNA后EC9706细胞较未转染及转染Control siRNA组细胞相比,MRP1 mRNA和蛋白的表达均减少(P<0.05).结论:HIF-1α上调食管鳞状细胞癌细胞中MRP1的表达可能是乏氧条件下化疗耐药的机制之一;HIF-1α可望成为新的食管鳞状细胞癌治疗的靶点.