α-突触核蛋白功能片段向多巴胺能神经细胞内的转运及其对细胞增殖的影响

目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)3个功能片段的促多巴胺能神经细胞增殖作用并且观察其亚细胞分布。方法原核表达重组人野生型α-Syn及其3个功能片段:N-末端、NAC片段和C-末端。向MES 23.5多巴胺能神经细胞的培养基中添加α-Syn及其3个功能片段,观察α-Syn全长及其3个功能片段对细胞的增殖的影响的生长曲线,用细胞免疫荧光检测α-Syn及其功能片段向细胞内的进入和分布。结果α-Syn全长及其NAC片段和C-末端均可促进细胞的增殖,但其N-末端片段对细胞增殖无影响。α-Syn及其3个功能片段均可以进入MES23.5多巴胺能神经细胞,3个功能片段在细胞内的亚细胞分布不同:α-Syn全长分子分布于胞质和胞核,但胞核中的含量多于胞质;N-末端片段主要分布于胞质和突起;NAC片段分布于胞质;C-末端片段主要分布于细胞核中。结论α-Syn对细胞增殖的促进作用与其NAC片段以及C-末端片段的氨基酸排列顺序有关。α-Syn及其功能片段均可进入多巴胺能神经细胞内,但其亚细胞分布不同。     

α-突触核蛋白促进MES23.5细胞突起生长

目的研究人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)对MES23.5多巴胺能神经细胞突起生长的作用。方法 MES23.5细胞外添加α-syn蛋白,测定不同时间细胞突起的长度;免疫荧光双重标记法观察α-syn与β-微管蛋白之间的相互关系;ELISA方法检测细胞内β-微管蛋白含量。结果α-Syn处理组神经元突起的平均长度及β-微管蛋白的含量在培养1、4和24 h时均明显大于对照组;α-Syn的这一作用可被微管蛋白抑制剂秋水仙碱阻断;α-Syn与β-微管蛋白在细胞内共存。结论α-Syn具有促进MES23.5多巴胺能神经细胞突起生长的作用,该作用很可能通过影响微管蛋白的合成及微管的组装来完成。     

组蛋白脱乙酰化酶在α-突触核蛋白抑制酪氨酸羟化酶表达中的作用

目的探讨组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)参与α-突触核蛋白(-αsynuclein,-αSyn)的过表达抑制酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的可能机制。方法利用HDAC活性检测试剂盒检测MES 23.5多巴胺能神经细胞系和稳定转染-αSyn的细胞中HDAC的活性差异,应用Western-blot及RT-PCR检测转染-αSyn细胞系中HDAC抑制剂———曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对TH表达的影响。结果在转染-αSyn的细胞系中HDAC的活性显著高于未转染组;TSA增加了转染细胞内TH蛋白和mRNA的表达(P<0.05)。结论HDAC参与了多巴胺能神经元中-αSyn抑制TH表达的机制。     

α-突触核蛋白促进过氧化氢诱导的多巴胺能神经细胞凋亡

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的多巴胺能神经细胞凋亡中的作用。方法通过瞬时转染重组质粒pEGFP-α-syn和pcDNA-α-syn到MES23.5多巴胺能神经细胞建立过表达α-syn细胞模型。细胞外添加H2O2(200μmol/L)处理细胞。Hoechst 33258荧光标记细胞核及AO/PI(吖啶橙/碘化丙啶)双染检测细胞凋亡。Mitotracker线粒体探针标记线粒体。结果 H2O2可增加α-syn向线粒体和细胞核的转运;H2O2可单独引起细胞凋亡,但过表达α-syn细胞的凋亡率显著高于空载质粒转染细胞(P<0.05)。结论α-Syn增强了H2O2诱导的多巴胺能神经细胞凋亡。     

人Ndfip1基因在转染MES23.5细胞中的表达

目的应用携带人Ndfip1(Nedd4family interacting protein 1)基因的质粒pCMV6-XL5-Ndfip1转染MES 23.5多巴胺能神经细胞,检测其在细胞中的表达。方法应用Lipofectamine法转染MES 23.5细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MES 23.5细胞中Ndfip1mRNA的表达。结果该表达载体转染MES23.5细胞后,细胞内Ndfip1mRNA的表达水平明显增加(t=-8.295,P0.01)。结论 Ndfip1基因可在MES23.5细胞内表达,从而为进一步研究Ndfip1在神经元保护中的作用奠定了基础。     

α-突触核蛋白促进多巴胺能神经细胞表面NMDA受体的内在化

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)对多巴胺能神经细胞表面N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的影响及其机制。方法免疫荧光标记法和Western blotting分析法测定NMDA受体(NMDAR)和Rab5b含量。低钾休克抑制内吞,Rab5b反义寡核苷酸抑制Rab5b基因表达。以MES23.5多巴胺能神经细胞为模型,观察细胞外添加α-Syn蛋白对细胞膜NMDAR含量的影响以及内吞和Rab5b的作用。结果α-Syn(10μmol/L)明显上调Rab5b表达,下调细胞表面NMDAR;低钾休克及抑制Rab5b表达可消除α-Syn的这一作用。结论α-Syn通过上调Rab5b的表达促进NMDAR的内在化。     

Eya1基因过表达对MES23.5细胞凋亡的影响

目的 构建眼发育缺失1(Eya1)基因慢病毒载体,并探讨过表达Eya1对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的鼠多巴胺能神经元细胞MES23.5凋亡的影响。方法 构建过表达Eya1基因的慢病毒,并感染MES23.5细胞,筛选稳定表达Eya1的细胞株;6-OHDA药物处理诱导MES23.5多巴胺能细胞损伤模型,分为对照组、空载体组、过表达Eya1组;采用CCK-8法检测细胞活力、细胞凋亡Hoechst染色(Hoechst 33258)和Western blot检测过表达Eya1对细胞凋亡的影响。结果 酶切电泳显示目的基因重组至慢病毒载体,测序结果表明构建的Eya1基因过表达载体与Eya1基因编码序列完全一致;CCK-8显示6-OHDA药物处理后过表达Eya1组的细胞活力水平高于对照组(P<0.05);Hoechst 33258染色显示过表达Eya1组的细胞核浓缩聚集水平低于对照组;且过表达Eya1组中Bcl-2蛋白的表达高于对照组(P<0.05),Bax蛋白的表达低于对照组(P<0.05)。结论 成功构建了过表达Eya1的MES23.5细胞株,Eya1通过调控Bcl-2、...     

α-突触核蛋白对N-甲基-D-天门冬氨酸所致细胞毒性作用的影响

目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)对N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)引起的多巴胺能神经细胞毒性作用的影响。方法在MES23.5多巴胺能神经细胞建立NMDA细胞毒模型,MTS法检测细胞活力,AO/PI荧光标记以及免疫印记测定caspase-3表达检测细胞凋亡,细胞外添加α-Syn蛋白,观察α-Syn对NMDA所致细胞毒性作用的影响。结果 NMDA(5mmol/L)引起明显的细胞内Ca2+升高以及细胞毒性作用,表现为细胞活力下降、凋亡细胞增加以及caspase-3表达升高。NMDA的细胞毒性作用可被NMDA受体特异性阻断剂MK801阻断。预先用α-Syn(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)处理细胞明显抑制NMDA引起的细胞内Ca2+升高以及细胞毒性作用,其作用随α-Syn浓度增高而增强。结论α-Syn对NMDA所致多巴胺能神经元的细胞毒性作用具有抑制作用,其机制可能与其抑制与NMDA引起的Ca2+内流以及caspase-3激活有关。     

抑制葡糖脑苷脂酶对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白寡聚体形成及细胞自噬功能的影响

目的 研究抑制葡糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GBA）活性对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成及自噬功能的影响.方法 在培养MES23.5细胞外添加不同浓度的GBA活性抑制剂（conduritol-β-epoxide,CβE）,观察GBA活性的变化,同时在细胞外添加α-Syn单体使其进入细胞内并孵育48 h.使用双抗体夹心ELISA方法测定细胞内α-Syn寡聚体含量,观察细胞自噬活性、氧化应激和凋亡.结果 随着CβE质量浓度的增加,GBA活性呈质量浓度依赖性的下降,而细胞内α-Syn寡聚体的含量则呈质量浓度依赖性的增加;在CβE处理细胞,随着细胞外添加的α-Syn单体的质量浓度加大,自噬活性和氧化应激液增强,同时细胞凋亡数量增加.结论 抑制GBA活性导致细胞内α-Syn寡聚体增多以及依赖于α-Syn浓度的自噬活性和氧化应激增强和细胞凋亡增加.     

凝血酶敏感蛋白-1在液压冲击损伤体外培养大鼠海马神经细胞中的表达及意义

目的探讨凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)在液压冲击损伤大鼠体外培养海马神经细胞中的表达。方法建立体外原代培养神经细胞液压冲击损伤模型,采用甲苯胺蓝染色观察神经细胞损伤程度,免疫细胞化学染色和Western blot技术检测神经细胞中TSP-1的表达水平。结果液压冲击后,甲苯胺蓝染色显示,损伤组部分神经细胞胞体浓缩,细胞核固缩,呈深蓝色,多为坏死型损伤细胞。免疫细胞化学染色显示,对照组神经细胞内有一定量的TSP-1表达,损伤组神经细胞内TSP-1表达增多,阳性细胞数目增多。Western blot结果显示,对照组和损伤组光密度值分别为0.937±0.194与2.318±0.495,损伤组神经细胞TSP-1蛋白表达显著强于对照组(P<0.01)。结论体外培养大鼠海马神经细胞中TSP-1高表达可能在液压冲击损伤过程中起重要作用。     

低密度脂蛋白对体外培养的肾小球系膜细胞表型转化的影响

目的通过低密度脂蛋白(LDL)的刺激,观察LDL对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞表型转化的诱导作用。方法采用不同浓度的LDL(0,25,50,100,150μg/ml)刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞的水平,以台盼蓝染色检测LDL对系膜细胞的毒性作用,MTT比色法检测细胞增殖,透射电镜观察系膜细胞的形态学变化,免疫细胞化学染色及Western blot检测α-SMA、CTGF、Ⅳ型胶原及FN的表达。结果在LDL作用下,倒置显微镜下细胞变为长梭形,透射电镜下细胞表面微绒毛减少。免疫细胞化学染色及Western blot显示α-SMA、CTGF、Ⅳ型胶原及FN表达增强。结论在LDL刺激下,系膜细胞可以发生表型转化。     

佛波醇酯对MES 23.5细胞铁调节蛋白1表达的影响

目的探讨蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波醇酯(PMA)对MES 23.5细胞中铁调节蛋白1(IRP1)的激活作用。方法采用MTT法观察细胞的存活率,Western Blot法检测IRP1和铁转出蛋白(Fpn1)的表达变化。结果 0.01~2.00μmol/L的PMA作用MES 23.5细胞24 h后,细胞存活率无明显变化(F=3.050,P>0.05)。0.20μmol/L的PMA作用MES 23.5细胞24 h后,IRP1表达明显上调(t=4.501,P<0.01),Fpn1表达明显下调(t=5.174,P<0.01)。结论 PMA在多巴胺能神经细胞系MES 23.5细胞中能明显激活IRP1。     

冬凌草甲素促进骨肉瘤细胞143B凋亡及其可能机制

目的 研究冬凌草甲素(oridonin,ORI)对人骨肉瘤细胞株增殖抑制和凋亡诱导作用的分子机制.方法 以结晶紫染色和Western blot检测ORI对143B细胞增殖的抑制作用,Annexin V-EGFP染色法和Western blot检测ORI对143B细胞凋亡的促进作用;RT-PCR和Western blot检测ORI对143B细胞内Wnt/β-catenin信号的影响;沉默或过表达β-catenin后,结晶紫染色分析ORI对143B细胞增殖的抑制作用的变化.结果 ORI能够抑制143B细胞株增殖,并诱导其凋亡(P＜0.05);呈浓度依赖性抑制143B细胞PCNA的表达,同时促进其Caspase3、Bad的表达;能够抑制143B细胞内Wnt/β-catenin信号的表达,沉默或过表达β-catenin后则可以相应地促进或抑制143B细胞的凋亡(P＜0.05).结论 ORI能够浓度依赖性抑制143B骨肉瘤细胞株增殖并诱导其凋亡,可能与ORI能够抑制其Wnt/β-catenin信号转导有关.     

人类疱疹病毒6A对神经细胞的嗜性及细胞周期的影响

目的:研究人类疱疹病毒6A对神经细胞嗜性及细胞周期的影响。方法:HHV-6A GS株感染神经细胞,倒置显微镜观察细胞病变。PCR法鉴定神经细胞中HHV-6A U22基因,实时荧光定量PCR法测定神经细胞中HHV-6A U22基因的相对含量。免疫细胞化学和Western blot检测神经细胞中HHV-6A糖蛋白gB的表达。神经细胞感染HHV-6A后MTT法测定细胞增殖的改变,流式细胞仪检测神经细胞周期的改变。结果:HHV-6A GS株感染5天后,U373细胞形态无明显变化,SK-N-SH和SHG44细胞聚集,折光性降低,细胞发生明显病变。PCR法检测到U373、SK-N-SH和SHG44细胞中均含有HHV-6A U22基因,实时荧光定量PCR法发现随着感染天数的增加,HHV-6A DNA在细胞中含量逐渐降低。免疫细胞化学和Western blot结果显示病毒糖蛋白gB在细胞中表达,其中在U373细胞和SHG44细胞中的表达量高于SK-N-SH细胞。MTT法显示HHV-6A促进U373细胞和SHG44细胞的增殖,抑制SK-N-SH细胞的增殖。流式细胞仪检测细胞周期,结果显示U373和SHG44细胞感染组与对照组相...     

地黄多糖在诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中对Notch1蛋白表达的影响

目的探讨地黄多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的作用,及其对Notch1蛋白表达的影响。方法以大鼠BMSCs为研究对象,取第3代细胞,分为对照组、β-巯基乙醇诱导组(5mmol/L BME)和地黄多糖诱导组(0.2 mg/mL)进行诱导实验,应用流式细胞仪检测诱导前后细胞生长周期改变情况,免疫细胞化学染色法检测神经标志物:神经巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch1蛋白的表达,Western blot检测Notch蛋白胞内片段(NICD)的表达情况。结果流式细胞仪检测示地黄多糖诱导后G0/G1期细胞比例明显升高,而S+G2/M期的细胞比例明显下降。免疫细胞化学染色显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后产生特异性神经细胞标志物表达。其中地黄多糖组nestin及NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇诱导组(P<0.05);GFAP阳性细胞率低于β-巯基乙醇诱导组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示地黄多糖诱导组诱导前为Notch1蛋白强阳性或阳性染色,并随诱导时间延长阳性细胞逐渐减少。Western blot结果显示地黄多糖诱导组诱导分化24 h后细胞内NICD含量逐渐下降,到第5天时,低于诱导前水平,且仍明显低于对照组。结论地黄多糖可能通过抑制Notch1蛋白表达而诱导BMSCs向神经样细胞分化,且主要向神经元样细胞方向分化。     

Effect of rehmannia glutinosa polysaccharide on the expression of Notch1 protein in rat bone marrow mesenchymal stem cells during differentiation into neuron-like cells in vitro.

目的 探讨地黄多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的作用,及其对Notch1蛋白表达的影响.方法 以大鼠BMSCs为研究对象,取第3代细胞,分为对照组、β-巯基乙醇诱导组(5 mmol/L BME)和地黄多糖诱导组(0.2 mg/mL)进行诱导实验,应用流式细胞仪检测诱导前后细胞生长周期改变情况,免疫细胞化学染色法检测神经标志物:神经巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch1蛋白的表达,Western blot检测Notch蛋白胞内片段(NICD)的表达情况.结果 流式细胞仪检测示地黄多糖诱导后G0/G1期细胞比例明显升高,而S+G2/M期的细胞比例明显下降.免疫细胞化学染色显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后产生特异性神经细胞标志物表达.其中地黄多糖组nestin及NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇诱导组(P<0.05);GFAP阳性细胞率低于β-巯基乙醇诱导组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示地黄多糖诱导组诱导前为Notch1蛋白强阳性或阳性染色,并随诱导时间延长阳性细胞逐渐减少.Western blot结果显示地黄多糖诱导组诱导分化24 h后细胞内NICD含量逐渐下降,到第5天时,低于诱导前水平,且仍明显低于对照组.结论 地黄多糖可能通过抑制Notch1蛋白表达而诱导BMSCs向神经样细胞分化,且主要向神经元样细胞方向分化.     

茶多酚及其提取物EGCG抑制MPTP致α-突触核蛋白聚集

目的 研究茶多酚及其提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对帕金森病神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)引起的α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)聚集的影响。方法 健康雌性食蟹猴(10~12岁),采用数字表法随机分为正常对照组、茶多酚对照组(TP组)、帕金森病模型组(MPTP组)和茶多酚治疗组(MPTP + TP组),每组4只。正常对照组不进行任何处理;茶多酚对照组灌胃给予茶多酚80 d;帕金森病(Parkinson's disease, PD)模型组静脉给予MPTP诱导PD模型;茶多酚治疗组在PD模型建立后给予茶多酚治疗80 d。实验动物经安乐死后,分离脑组织,ELISA法检测不同脑区寡聚化α-syn含量。体外培养MES23.5多巴胺能神经细胞,细胞外添加α-syn单体或寡聚体后,再经MPP⁺和/或EGCG处理,ELISA法检测细胞内α-syn寡聚体的量,MTT法检测各组多巴胺能神经细胞损伤情况。结果 MPTP增加猴脑组织寡聚化α-syn含量,治疗性给予茶多酚减少MPTP引起的α-syn聚集。体外研究表明,MPP⁺可明显增加对照组、α-syn单体和寡聚体处理组细胞的细胞内α-syn寡聚体的量,而茶多酚提取物EGCG可以抑制MPP⁺引起的细胞内α-syn聚集,并缓解MPP⁺所致细胞损伤。结果 茶多酚及其提取物EGCG可以抑制PD神经毒素MPTP引起α-syn聚集和多巴胺能神经元损伤。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向神经细胞分化的潜能。方法体外培养人BMMSCs,并诱导其向神经细胞分化。诱导前后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞类型,流式细胞术检测细胞周期以确定细胞增殖活性。结果分离培养的BMMSCs有克隆增殖能力。诱导后,分化细胞呈现典型神经元的表型,且免疫荧光染色呈NSE阳性。流式细胞术分析显示诱导前BMMSCs的增殖指数(PI)较高,细胞增殖活跃。与诱导前比较,诱导分化细胞的PI显著降低(P<0.01),细胞增殖发生抑制,而分化阶段各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMMSCs可以在体外增殖扩增,并能分化为神经元样细胞,且分化的神经元样细胞能较长时间存活。     

兔骨骼肌干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

目的:探讨兔骨骼肌干细胞(MDSCs)分离、鉴定及诱导分化为平滑肌细胞的方法。方法:应用酶消化法消化兔骨骼肌组织,应用改良差速贴壁法获得MDSCs,并用免疫组化和免疫荧光鉴定,体外诱导骨骼肌干细胞向平滑肌细胞定向分化,镜下观察细胞生长情况;Real-time PCR和Western blot检测平滑肌细胞特异标记α-SMA和SM-MHC的表达情况。结果:骨骼肌干细胞具有良好的增殖能力和分化潜能,免疫细胞化学染色法和免疫细胞荧光法显示MDSCs呈结蛋白、干细胞抗原-1(Sca-1)和CD34阳性,CD45阴性,诱导后细胞排列形态呈漩涡状,Real-time PCR和Western blot结果提示α-SMA和SM-MHC表达增高。结论:骨骼肌干细胞经体外培养及诱导后,呈明显的平滑肌细胞特性,可作为输尿管组织工程新的种子细胞来源。     

SHP-1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖活性的影响

目的 初步观察转染SHP-1基因前后MDA-MB-231细胞SHP-1蛋白表达情况及转染SHP-1基因对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响.方法 构建真核表达载体pEGFP-C3-SHP-1,利用脂质体转染法转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,经G418筛选阳性克隆.用免疫细胞化学和Western blot检测SHP-1基因在MDA-MB-231细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法观察细胞生长曲线.结果 蛋白水平证实,转染细胞内有SHP-1基因的高表达,转染后细胞增殖能力明显受抑制(P＜0.05).结论 向无SHP-1基因表达的MDA-MB-231细胞内转染SHP-1基因并使其稳定表达,可以使MDA-MB-231细胞的增殖受到抑制,为以后进一步探讨SHP-1基因的功能打下了基础.