乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养

目的:探讨一种简便、可靠的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞培养方法。方法:以组织块酶消化法分离细胞,通过差速贴壁分离法收集、培养乳鼠心肌细胞和成纤维细胞。普通光学显微镜观察心肌细胞和成纤维细胞的基本特征及生长特性的变化。结果:心肌细胞12 h基本贴壁、1~3天形成细胞簇并出现同步搏动,心肌细胞纯度为93%;心肌成纤维细胞第3~6代细胞生长良好,纯度达98%以上。结论:建立的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞体外培养方法是成熟、可靠的。     

骨髓间充质干细胞向心肌诱导过程中GATA-4和Nkx2.5基因的表达

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌诱导分化过程中,心肌转录因子GATA.4和Nkx2.5基因表达的变化规律,探讨其分子生物学机理.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代以10 pmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)诱导.分别于第1、2、3、4周收集细胞,免疫细胞化学法和Western blot法检测肌钙蛋白I(troponinI,TnI)表达·RT-PCR法分析GATA-4和Nkx2.5基因的表达.结果 诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周开始出现TnI阳性细胞,第1周开始即有GATA-4和Nkx2.5基因表达,逐渐增强,第3周达到高峰,持续到第4周.结论 GATA·4和Nkx2.5基因表达在骨髓同充质干细胞向心肌样细胞诱导过程中逐渐增强,可能参与调控心肌细胞的分化过程.     

miR-1、miR-16和miR-208前体在乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达

目的检测心肌特异的miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中的表达。方法利用出生1～3d的Sprague-Dawley(SD)大鼠和C57BL/6小鼠,采用2.5%胰酶消化和差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞。提取原代的乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及P1代的心肌成纤维细胞总RNA,以β-actin为内参照,逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测miR-1、miR-16和miR-208的前体表达水平。用FluorChem8900软件分析琼脂糖凝胶电泳后PCR产物条带的灰度值,计算出表达的目的miRNA前体与β-actin的比值。结果有效分离并培养了乳C57BL/6小鼠、乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞。RT-PCR结果显示,在乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中miR-1和miR-16均有相近水平的表达;心肌细胞中miR-208的表达显著低于miR-208b(P0.01),miR-208b在心肌细胞中的表达显著高于其在心肌成纤维细胞中的表达(P0.05)。乳C57BL/6小鼠心肌细胞中miR-1a-1的表达显著低于miR-1a-2(P0.01),而miR-1a-2在心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达水平一致;miR-16-1在心肌细胞和心肌成纤维细胞中表达水平相近,而miR-16-2在两种细胞中均不表达;心肌细胞中miR-208a和miR-208b表达水平差别不明显,心肌成纤维细胞中只有miR-208a表达,并且在水平上低于其在心肌细胞中的表达(P0.05)。结论 miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中呈细胞特异性的表达。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法

目的探讨乳鼠心肌细胞的原代培养方法,更好地获取高存活率、高搏动率及高纯度的心肌细胞,以建立良好的原代心肌细胞研究模型。方法无菌状态下取出生3 d以内Wistar乳鼠心室肌,以混合消化酶（0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合液）反复进行短时间多次消化,用差速贴壁法纯化心肌细胞,并加入5-溴脱氧尿嘧啶抑制非心肌细胞分裂增殖,2 d后首次换液,以后隔日换液。结果心肌细胞24 h左右已基本贴壁,并可见单个细胞搏动,2～6 d形成单层心肌细胞和其细胞簇的同步搏动,经培养所获细胞搏动良好,存活率高,免疫组化鉴定显示培养的心肌细胞纯度95%以上。结论该方法是一种较为理想的乳鼠原代心肌细胞培养方法,值得进一步推广。     

外源性Nkx2.5、GATA4促进大鼠骨髓间充质干细胞的心肌分化

目的:心脏早期转录因子Nkx2.5、GATA4转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨Nkx2.5、GATA4对大鼠BMSCs向心肌细胞分化的作用和影响。方法:全骨髓法分离、纯化、扩增培养SD大鼠BMSCs,流式细胞术联合检测第三代细胞表面分子,CD90+/CD29+/CD45-细胞达95%以上。采用阳离子转染试剂LipofectamineTM2000将p EGFP-N1-Nkx2.5、p VP22-GATA4/myc-His质粒转染BMSCs。结果:转染4周后,Western blotting、免疫细胞化学结果表明,与空质粒组、空白对照组相比,Nkx2.5、GATA4显著提高转染组大鼠心肌细胞肌钙蛋白T(cardiac troponin T,c Tn T)、连接蛋白43(connexin43,Cx43)的表达。免疫细胞化学结果显示Nkx2.5转染组、GATA4转染组中部分细胞呈c Tn T、Cx43阳性,c Tn T阳性细胞的胞质中可见棕黄色丝网状及颗粒样结构,Cx43阳性细胞的细胞质中可见棕褐色颗粒。透射电镜观察各组细胞超微结构变化,转染组大鼠心肌细胞的细胞质内出现大量平行排列的肌丝样结构,细胞侧面或细胞末端可见较多缝隙连接。结论:外源性Nkx2.5、GATA4能够促进BMSCs向心肌细胞分化。     

刺参黏多糖对Hela细胞增殖分化的影响

目的 了解刺参酸性黏多糖(SJAMP)对Hela细胞增殖、分化的影响及其机制.方法 体外培养Hela细胞,通过MTT法观察SJAMP对Hela细胞增殖的作用,电镜观察SJAMP作用下Hela细胞超微结构的变化,RT-PCR法检测Hela细胞CyclinD1、CDK4、C-myc的mRNA的表达.结果 SJAMP能够有效抑制Hela细胞的增殖,并且具有剂量和时间依赖关系.透射电镜观察显示,SJAMP可诱导细胞向成熟细胞分化;SJAMP可以明显降低CyclinD1、CDK4、C-myc的mRNA表达.结论 SJAMP可能是通过抑制细胞周期因子CyclinD1和CDK4的表达而抑制细胞增殖,通过抑制癌基因C-myc的表达来诱导Hela细胞分化.     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的分离培养及鉴定

探讨大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞体外分离及培养的方法.采用0.125％胰酶多次消化法收集新生SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞.高内涵细胞成像法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot和RT-PCR法检测波形蛋白表达水平,CD90标记成纤维细胞、鉴定细胞纯度.最新消化分离得到的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个散在或聚集成团分布,90 min后即有大量细胞贴壁,其中部分细胞已开始伸展.5～6 d可形成单层细胞,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形.波形蛋白表达呈强阳性.传代3代的细胞培养体系中成纤维细胞约占87％.含5％FBS的DMEM/F12培养基培养24 h即可检测到细胞的大量增殖.胰酶消化法是获得大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的有效方法.     

小鼠胚胎心脏发育过程中组蛋白乙酰化酶亚型p300调控心脏特异转录因子的动态表达

目的:观察小鼠胚胎心脏发育过程中GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的动态表达和这些基因的启动子区域组蛋白H3乙酰化修饰状态的变化,以及组蛋白乙酰化酶亚型p300对这些基因启动子的直接调控作用,为进一步研究先天性心脏疾病的发生机制奠定基础.方法:选取胎龄(Embryo day,E)10.5d和16.5d小鼠正常胚胎心脏,用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)的方法观察上述基因mRNA的动态表达;采用染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,ChIP),用ChIP级抗乙酰化H3和抗p300抗体免疫沉淀与其所结合的DNA,采用Real Time PCR扩增抗体所富集的上述基因启动子的DNA量,观察胚胎心脏发育过程中乙酰化组蛋白及组蛋白乙酰化酶亚型p300是否参与调控上述四种心脏特异转录因子的表达.结果:①胎龄E10.5d和E16.5d小鼠胚胎心脏的GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的mRNA表达水平都有明显差异(P<0.05),其中GATA4和MEF2C mRNA相对β-actin的表达水平,E10.5明显低于E16.5,而Nkx2.5和Tbx5 mRNA相对表达水平,E10.5明显高于E16.5;并且ChIP结果显示这些基因启动子的乙酰化水平也随着时间而改变,但差异无统计学意义.②E10.5和E16.5胚胎小鼠心脏中,p300抗体均能免疫沉淀GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因启动子,其沉淀的基因量在这两个小鼠心脏发育的关键时间点有所不同,但差异无统计学意义.结论:小鼠胚胎心脏发育过程中,心脏发育相关基因GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5呈现动态表达,提示这些基因在心脏发育不同阶段具有重要作用.ChIP结果提示p300介导的组蛋白乙酰化修饰可能为调节这些基因动态表达的机制之一.     

心肌细胞种植的研究进展

各种原因引起的心肌梗死是临床上重要的死亡原因。利用细胞种植可以增加有功能的心肌细胞数量和质量 ,但是供体细胞来源受限。干细胞是一类具有无限增殖和多向分化潜能的细胞 ,进行合适的诱导可使其向心肌细胞方向分化 ,为临床缺血性心脏病进行细胞移植治疗提供新的途径     

心肌细胞的机械感受与传导

机械感受及传导是广泛存在的,是细胞为适应外界环境变化而逐渐进化演变而成,也是细胞难以理解的一个生理特性.从植物细胞到动物细胞,几乎已知的所有细胞类型都存在某种机械感受传导能力.机械刺激,既有外部的,也有内部的.外界刺激可以是静态的、逐渐变大变小的、也可以是周期性的.外界机械刺激一般包括静水压、剪切力、扭转力、压力、牵张力、以及高频振动.内部主要由细胞骨架通过推拉胞膜和细胞内细胞器而产生.机械刺激作用于细胞后,细胞膜或胞浆中的特定结构能够感受机械刺激并将刺激传入胞内,引起细胞增生、分化、凋亡、迁移等多种生理功能的变化.心脏作为心血管系统的核心,处于不断地舒缩过程中,并时刻受到血流的冲击,其机械感受及传导功能在心脏生理和病理过程中的作用理所当然的受到关注.     

心肌细胞对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的：观察大鼠成体心肌细胞对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化的诱导作用。方法：应用Percoll’s密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，传2代后用流式细胞术检测其表面CD34,CD71和CD90的表达，然后用Lipofectamine2000介导pEGFP-N3转染标记MSCs。将GFP标记的MSCs与新鲜分离的成体大鼠心肌细胞分别按接触、非接触（MILLICELLTM-HA半透膜分层培养）及心肌细胞条件培养液培养。1周后应用免疫荧光检测MSCs α-actin，desmin和cTnT的表达。结果：接触培养组中可见表达GFP的MSCs细胞同时表达α-actin,desmin和cTnT，而分层培养组及条件培养组中均未见α-actin，desmin和cTnT的表达。结论：大鼠成体心肌细胞与MSCs接触培养，可能诱导MSCs分化为心肌细胞。     

同种大鼠心肌细胞移植研究

目的　评价大鼠胎鼠和新生鼠心肌细胞同种移植后的收缩能力及它们在纤维组织中的生存能力 ,为临床心肌细胞移植提供相关依据。方法与结果　将筛选的胎鼠和新生鼠的心肌细胞进行培养 ,将两种心肌细胞悬浮液注射到成年同种同品系大鼠后肢的皮下纤维组织中 ,用环孢素A(5mg/kg)进行免疫抑制。 3个月后处死大鼠 ,移植的心肌细胞在体内形成心肌组织样结构 ,且仅在移植的前 2周其体积不断增大。源于胎鼠的心肌移植组织的自发收缩能力为 (73± 12 )次 /min ,而源于新生鼠心肌移植组织的自发收缩能力为 (4 3± 2 1)次 /min ,心电图显示其收缩节律与心脏室性收缩节律相似。从组织发育程度上来看 ,移植组织呈现出有心肌样肌小节结构 ,并有血管生成。结论　将悬浮培养的大鼠胎鼠和新生鼠心肌细胞注射到同种同品系的成年大鼠后肢皮下纤维组织中 ,形成了具有自发收缩节律的心肌样组织     

大鼠成体心肌细胞的分离和培养

目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4～6∶ 1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.     

成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术

目的建立稳定的成年大鼠心肌细胞分离和培养方法,以便进行成年大鼠心肌细胞收缩功能的研究。方法将成年大鼠心脏挂于Langendorff装置上灌流,胶原酶消化分离成年大鼠心肌,无血清悬浮培养心肌细胞。光镜观察,结合形态学和收缩功能评价心肌细胞。结果新分离的心肌细胞的收获量为(4~6)×106个,杆状和圆形,其中长杆状细胞大于75%,横纹清晰,收缩幅度(12.00±2.68)%。无血清培养24 h后,细胞保持完整的形态结构,长杆状心肌细胞占总数的70%以上,收缩幅度(11.78±1.59)%,与刚培养时的细胞相比,无显著差别(P>0.05)。结论通过本方法可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离培养。     

三氧化二砷对心肌细胞的毒性及其机制的探讨

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对H9c2心肌细胞株凋亡的诱导及其机制.方法 H9c2细胞培养,不同浓度As2O3干预后,采用MTT、AO/EB染色法、CaspACE检测系统观察细胞存活率、形态并检测凋亡.结果 As2O3(2～10 μmol/L)使H9c2心肌细胞株活力下降;AO/EB染色法观察可见细胞凋亡的特征形态;Caspase-3阻断剂AcDEVD-CHO可以阻断As2O3诱导的凋亡.结论 As2O3诱导的H9c2心肌细胞株凋亡,Caspase-3的激活是其所致凋亡的机制之一.     

心肌细胞损伤模型构建及应用的研究进展

心肌细胞损伤模型目前被广泛应用于心血管疾病的分子机制及药物作用的研究,因各种模型的形成机制不 同,选择合适的模型非常重要。临床心血管疾病的病理变化相对复杂,根据其特点采用的心肌细胞损伤模型主要有过 氧化氢心肌细胞损伤模型、缺氧/复氧心肌细胞损伤模型、阿霉素心肌细胞损伤模型、高糖/高脂心肌细胞损伤模型、异 丙肾上腺素心肌细胞损伤模型等。几种模型均有优缺点,需要根据研究内容选择相对合适的心肌细胞损伤模型。     

成年SD大鼠心肌细胞的培养

目的: 建立稳定的成年SD大鼠心肌细胞分离和培养的方法.方法: 主动脉插管逆行灌流分离成年SD大鼠心肌细胞,进行体外培养,并观察其形态的变化.结果: 刚分离的心肌细胞呈长杆状,表面有明显横纹,非同步博动,在含血清的培养环境中,细胞形态很快发生变化,出现去分化表现,在无血清的培养环境中,细胞保持刚分离时的在体形状,2 wk后细胞均明显萎缩.结论: 主动脉插管逆行灌流的方法是较为理想的成年SD大鼠心肌细胞分离与培养方法.     

促红细胞生成素对乳鼠缺氧心肌细胞的保护作用及机制

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）发挥心肌细胞保护作用的可能分子机制。方法：采用流式细胞仪检测各组心肌细胞的存活率、凋亡率和坏死率。将心肌细胞分为正常对照组、缺氧组、缺氧＋EPO组。采用North-ern-blot方法检测各组心肌细胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA的表达,采用Western-blot方法检测各组心肌细胞中的CytC、STAT-3、Caspase-3蛋白的表达。结果：3组心肌细胞的存活率,凋亡率和坏死率差异显著（92．1％w70．9％vs89．0％,2．3％vs18．73％Fs6．0％,3．5％US8．0％傩3．5％,P〈0．01）。IU／mL EPO开始发挥对缺氧心肌细胞的保护作用,5U／mL、25U／mL和125U／mL的保护作用相似。与缺氧组相比：EPO组Bcl-2mRNA和STAT-3蛋白表达增加（P〈0．01）,Bax、Caspase-3mRNA和Caspase-3蛋白表达减少（P〈0．01）。结论：5U／mL的EPO是其发挥心肌细胞保护作用的最佳浓度。缺氧心肌细胞中,EPO可能通过JAK-STAT途径发挥抗凋亡的作用。