结核分枝杆菌对miR-21和TLR-4/NF-κB信号通路的影响研究

目的 研究结核分枝杆菌(Mtb)H37Rv及BCG感染RAW264.7和THP-1细胞后,对miR-21表达及Toll样受体(TLR)-4/核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响.方法 体外培养RAW264.7和THP-1细胞及Mtb H37Rv、BCG;建立Mtb感染RAW264.7和THP-1细胞模型;RAW264.7及THP-1细胞分别分为对照组,H37Rv感染组,BCG感染组;利用流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21、TLR4、NF-κB mRNA表达;利用ELISA检测感染12 h后细胞上清液、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-10水平.结果 与对照组比较,H37Rv感染组及BCG感染组RAW264.7、THP-1细胞凋亡率均明显升高(P<0.05).与H37Rv感染组比较,BCG感染组THP-1细胞凋亡率明显升高,RAW264.7凋亡率明显降低(P<0.05).在RAW264.7细胞中,BCG感染组及H37Rv感染组miR-21低表达,而TLR4、NF-κB mRNA高表达,且BCG感染组TLR4、NF-κB mRNA较H37Rv感染组高表达(P<0.05).在THP-1细胞中,BCG感染组及H37Rv感染组miR-21低表达,TLR4、NF-κB mRNA高表达,且BCG感染组TLR4、NF-κB mRNA较H37Rv感染组高表达(P<0.05).在RAW264.7细胞中,BCG感染组及H37Rv感染组TNF-α、IL-6、IL-10表达水平均明显升高,BCG感染组TNF-α、IL-6表达水平较H37Rv感染组明显降低,IL-10明显升高(P<0.05).在THP-1细胞中,BCG感染组及H37Rv感染组TNF-α、IL-6、IL-10表达水平均明显升高,BCG感染组TNF-α、IL-6表达水平较H37Rv感染组明显升高,IL-10明显降低(P<0.05).结论 Mtb感染巨噬细胞后,可能通过抑制机体miR-21表达,从而激活TLR-4/NF-κB信号通路,促进巨噬细胞凋亡.     

蔓荆子黄素对小鼠单核巨噬细胞 增殖和凋亡的影响

目的 通过蔓荆子黄素对小鼠腹腔巨噬细胞活性及RAW264.7 细胞增殖和凋亡作用的研究,探讨蔓荆 子黄素对单核巨噬细胞的影响。方法 分别用含有不同浓度蔓荆子黄素作用于小鼠腹腔巨噬细胞与小鼠单核巨噬 细胞RAW264.7,于24、48 及72 h 后采用CCK-8 检测细胞活性。使用AO/EB 染色观察RAW264.7 细胞凋亡 变化;应用流式细胞仪检测RAW264.7 细胞凋亡率。通过荧光探针DCFH-DA 检测RAW264.7 细胞活性氧 水平,使用JC-1 染色标记线粒体膜电位的变化。结果 CCK-8 法检测结果显示,蔓荆子黄素对小鼠腹腔巨噬细胞 的细胞活性及RAW264.7 细胞的增殖都有抑制作用,呈剂量与时间依赖关系,尤其对具有增殖能力的RAW264.7 细胞活性抑制作用更强。AO/EB 染色结果显示,RAW264.7 细胞经浓度为5 及10 μmol/L 的蔓荆子黄素处理后, 细胞表现为凋亡形态;流式细胞仪检测结果显示,蔓荆子黄素诱导RAW264.7 细胞Sub-G1 期代表凋亡细胞 的百分比增加（P <0.05）。蔓荆子黄素作用于RAW264.7 细胞后,细胞内活性氧水平提高;JC-1 染色结果显示, 蔓荆子黄素能使RAW264.7 细胞的线粒体膜电位下降。结论 蔓荆子黄素能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞与小鼠 单核巨噬细胞RAW264.7 活性,尤其对具有增殖能力的RAW264.7 细胞活性抑制作用更强,可以促进其凋亡, 其作用机制与增加细胞内活性氧水平和降低线粒体膜电位有关。     

右美托咪定对脂多糖诱导RAW264.7细胞凋亡的影响

目的：探讨右美托咪定（ DEX）对脂多糖（ LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响。方法：体外培养小鼠巨噬细胞系 RAW264.7,细胞随机分为正常对照组、LPS刺激组（10 mg/L）、DEX组（0.1、1、10、100μmol/L）和LPS＋DEX组（0.1、1、10、100μmol/L）;采用四甲基偶氮唑盐（ MTT）微量酶反应比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质免疫印迹法（ western blot）检测bax、bcl-2蛋白表达。结果：与正常对照组相比,DEX组（浓度为0.1、1、10μ mol/L ）对RAW 264.7细胞生存率、凋亡率以及bax、bcl-2的表达影响不明显（ P﹥0.05）;100μmol/L DEX对RAW264.7细胞生存率、凋亡率明显下降,bax的表达明显增加,bcl-2表达降低（P﹤0.05）;与 LPS刺激组相比,LPS＋DEX组（0.1,1,10μmol/L）可增加RAW264.7细胞的生存率,降低细胞凋亡率,bax表达降低,bcl-2表达增加（ P﹤0.05）,LPS＋100μmol/L DEX组细胞生存率显著降低,凋亡率显著增加,bax表达明显增加,bcl-2表达显著降低。结论：低浓度DEX（﹤10μmol/L）抑制LPS诱导RAW264.7细胞凋亡,高浓度则表现为增强作用。     

亲环蛋白A对氧化低密度脂蛋白诱导RAW264.7细胞活化与凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨亲环蛋白A (cyclophilin A,CyPA)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein ,ox LDL）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7活化和凋亡的影响。方法: 体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,蛋白质印迹法检测40 mg/mL ox LDL诱导后RAW264.7细胞CyPA的表达。转染siRNA沉默CyPA的表达,转染阴性对照siRNA作为阴性对照组,使用40 mg/L ox LDL处理细胞24 h后,通过流式细胞术检测各组巨噬细胞表面标志CD80和CD86的阳性率、细胞凋亡率。结果： 与空白对照组相比,ox LDL干预24 h后RAW264.7细胞CyPA表达量显著增高。沉默CyPA表达后,与阴性对照组相比,CyPA沉默组在ox LDL干预24 h后CD80、CD86的表达明显降低,细胞凋亡明显减少。结论： CyPA可能参与介导ox LDL诱导的RAW264.7细胞活化与凋亡。     

携带Lipocalin 2基因重组减毒沙门菌的构建及其对分枝杆菌生长影响的研究

目的：探讨携带脂质运载蛋白2（lipocalin 2,Lcn2）的减毒沙门菌对分枝杆菌生长的影响。方法：以巨噬细胞RAW264.7提取RNA逆转录为cDNA为模版,采用PCR法扩增Lcn2基因,定向克隆到质粒pBudCE4.1-orim的多克隆位点中,构建重组质粒 pBudCE4.1-orim-Lcn2;将重组质粒转染RAW264.7细胞,用RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA 相对表达量,并以空白载体为对照组;将重组质粒转入减毒沙门菌SL7207得到重组菌株 SL7207-pBudCE4.1-orim-Lcn2;重组菌感染RAW264.7细胞,Western blot检测Lcn2的蛋白表达,RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA的相对表达量,并以空载菌组为对照;7H10平板上通过菌落计数观察重组菌对感染 RAW264.7 细胞的卡介苗（Bacille calmette-guerin,BCG）生存的影响,以空载菌组为对照。用重组菌灌胃小鼠,检测脾组织Lcn2和血清IFN-γ水平,以空载菌和生理盐水为对照组。结果：PCR扩增出Lcn2基因;重组质粒经双酶切及基因测序鉴定正确。重组菌感染 RAW264.7细胞Lcn2的蛋白表达量较对照组增加（P=0.000）。RT-qPCR 法检测重组菌、重组质粒Lcn2 mRNA表达较对照组明显升高（P=0.000,F=5.281;P=0.000,F=22570）。7H10平板上重组菌组BCG数量与空载菌组相比明显减少（P=0.000,F=11.41）。重组菌组与空载对照菌组相比小鼠脾组织 Lcn2表达升高（P=0.000,F=4.449）,重组菌组与生理盐水组血清IFN-γ升高（P=0.004,F=15.27）。结论：成功构建了携带Lcn2基因的重组减毒沙门菌。重组菌感染RAW264.7细胞后Lcn2的表达增加,对感染RAW264.7的BCG存活起到一定的抑制作用。重组菌灌胃后小鼠脾组织Lcn2表达增加,血清IFN-γ含量增加,小鼠免疫状态有利于结核病转归。该研究为进一步研究脂质运载蛋白和结核分枝杆菌感染的关系及分子机制打下基础。     

洛伐他汀对RAW264.7体外生长抑制作用的研究

目的通过细胞培养,观察洛伐他汀（lovastatin,LOV）对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的作用,探讨LOV对小鼠巨噬细胞株（RAW264.7）增殖和凋亡的影响。方法以不同浓度（20,40,80μmol/L）LOV处理RAW264.7,作用不同时间（24 h,48 h,72 h）,以MTT法检测LOV对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响;观察洛伐他汀对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响。结果洛伐他汀对小鼠巨噬细胞瘤RAW264.7有明显的抑制生长的作用（P〈0.05）,细胞凋亡形态观察显示,经80μmol/L洛伐他汀作用的细胞出现明显固缩的凋亡小体。结论洛伐他汀能有效抑制巨噬细胞株的体外生长,其作用与剂量、时间具有一定的依赖性,这种抑制作用可能与洛伐他汀诱导细胞凋亡有关。     

Daxx在介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡中的作用

目的 初步探讨Daxx在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡中的作用.方法 通过MTT比色法检测ox-LDL对小鼠源性巨噬细胞(RAW264.7)细胞生长的影响:用AO/EB染色、流式细胞仪和DNA断裂片段分析研究ox-LDL诱导的细胞凋亡.eal time PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达情况.结果 ox-LDL能抑制RAW264.7细胞的生长,抑制作用呈剂量-效应关系;50 mg/L ox-LDL处理RAW 264.7细胞48 h后,AO/EB染色细胞呈凋亡特征性改变,并且DNA断裂片段分析显示电泳图出现梯形条带;流式细胞检测显示相同时间不同浓度ox-LDL(0、12.5、25、50、75 mg/L)处理RAW264.7细胞48 h和相同浓度不同时间(50 mg/L,48、72 h)处理细胞,细胞凋亡率逐渐升高;Real time PCR结果表明不同时间和不同浓度的ox-LDL处理RAW264.7细胞后,Daxx mRNA表达水平呈时间和浓度依赖性增加,其中50 mg/L ox-LDL处理细胞48 h组Daxx mRNA表达最高.结论 ox-LDL有诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的作用,其机制可能与Daxx表达增高从而启动细胞凋亡有关.     

姜黄素改善N2a/APP695swe细胞线粒体功能和抑制细胞凋亡的作用

目的：观察姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞线粒体形态和功能及细胞凋亡的影响;探讨其可能的神经保护机制。方法：实验细胞分为4个组：N2a/APP695组（WT）、N2a/APP695swe组（APP）、溶剂对照组（DMSO,5 μmol/L）、姜黄素组（Curcumin,5 μmol/L）。流式细胞术分别检测细胞凋亡、活性氧水平和膜电位水平、免疫细胞化学检测细胞色素C的表达、电镜观察细胞线粒体形态的改变,Western blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达,分光光度检测Caspase3、Caspase9酶活性。结果：流式细胞术结果显示,Curcumin组细胞的凋亡率、活性氧水平较APP组明显降低[（0.05±0.01） vs. （0.18±0.01）,P=0.000;（49.67±4.16） vs. （197.67±8.08）,P=0.000];而Curcumin组线粒体膜电位较APP组升高[（1.00±0.03） vs. （0.64±0.03）,P=0.000]。电镜结果发现姜黄素可以减轻线粒体的肿胀,改善其形态。同时免疫细胞化学结果显示姜黄素减少了细胞色素C的释放。Western blot检测发现,与APP组相比,Curcumin组Caspase3、Caspase9蛋白的表达均降低[（0.62±0.12） vs. （1.39±0.10）,P=0.000;（0.64±0.20） vs. （1.78±0.03）,P=0.000];并且Curcumin组较APP组的Caspase3与Caspase9的活性明显降低[（0.66±0.04） vs. （2.12±0.06）, P=0.000;（0.58±0.04） vs. （0.93±0.03）, P=0.000]。结论：姜黄素能抑制N2a/APP695swe细胞的凋亡,其机制可能与改善线粒体功能有关。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用

【目的】研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）分泌蛋白ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kD）对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机理。【方法】应用流式细胞仪分析稳定表达ESAT-6和经重组ESAT-6蛋白作用的小鼠RAW264.7细胞的凋亡;应用Caspase-3检测试剂盒检测caspase-3活性变化;进一步应用Western blotting分析稳转细胞系ESAT-6表达情况。【结果】RAW-EGFP-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和RAW-EGFP细胞系（P〈0.05）;RAW-flag-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和相应对照细胞系（P〈0.01）。10μg/ml重组ESAT-6可显著诱导RAW264.7细胞凋亡,而5μg/ml重组ESAT-6无明显诱导细胞凋亡效果。稳转细胞系RAW-flag-ESAT-6细胞内flag-ESAT-6浓度大约只有500 ng/ml。【结论】胞内低水平表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡。     

凋亡细胞调控巨噬细胞表达IL-12家族细胞因子的水平

［摘要］ 目的观察凋亡细胞对巨噬细胞中白细胞介素12 （interleukin-12,IL-12）家族细胞因子表达的影响。 方法将小鼠巨噬细胞系RAW264.7（RAW 细胞）和小鼠腹腔巨噬细胞分别分为空白对照组、脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）刺激组（LPS组）、凋亡细胞刺激组（apo组）、脂多糖+凋亡细胞刺激组（LPS+apo组）,实时定量PCR检测各组细胞刺激前后mIL-12p35、mIL-12p40、mIL-23p19水平。采用酶联免疫吸附测定方法检测各组激活的RAW细胞培养液中IL-10、前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）和转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）的含量。 结果RAW细胞和小鼠腹腔巨噬细胞LPS组IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 mRNA表达量高于空白对照组和apo组,LPS+apo组IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 mRNA表达量高于空白对照组和apo组,低于LPS组（P＜0.05）。LPS组和LPS+apo组IL-10、PGE2、TGF-β浓度均高于对照组,LPS+apo组TGF-β浓度高于对照组和LPS组（P＜0.05）;LPS组和LPS+apo组IL-10、PGE2浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论凋亡细胞抑制活化巨噬细胞IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19 mRNA的表达。凋亡细胞对IL-10和PGE2分泌无影响,但促进TGF-β的分泌。     

FK506对癫痫大鼠凋亡细胞数及MMP和AIF表达的影响

目的 观察免疫抑制剂他克莫司（FK506）对癫痫大鼠海马凋亡神经元、线粒体膜电位、凋亡诱导因子(AIF)表达的影响。方法 随机将108只成年健康雄性Wistar大鼠分为对照组、癫痫组和脑保护组,每组36只,建立氯化锂-匹鲁卡品癫痫模型。脑保护组在注射匹鲁卡品之前24、1h分别腹腔注射FK506,对照组注射等体积生理盐水。应用TUNEL技术检测凋亡细胞,流式细胞仪测定线粒体内罗丹明123的荧光强度和线粒体的大小,免疫组化法检测AIF的表达。结果 与对照组相比,癫痫组海马神经元凋亡阳性百分比、AIF的表达量显著增高(P＜0.05）,线粒体膜电位显著降低(P＜0.05）,应用FK506后,神经元凋亡阳性百分比、AIF的表达量明显降低,线粒体膜电位显著升高(P＞0.05)。结论 FK506可逆转线粒体膜电位的改变,稳定细胞膜电位,抑制神经元的凋亡,具有脑保护作用。     

金银花提取物对哮喘模型小鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨金银花提取物对哮喘小鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖和凋亡的影响,阐明其相关的作用机制。方法：构建小鼠哮喘模型,分离原代ASMCs并进行鉴定。采用白细胞介素4(IL-4)诱导巨噬细胞RAW264.7 M2极化并进行鉴定。RAW264.7细胞分为对照组及低、中和高剂量金银花提取物组,对照组诱导RAW264.7细胞M2极化后与ASMCs共培养,低、中和高剂量金银花提取物组分别用不同浓度(50、100和200 mg·L^-1)金银花提取物处理RAW264.7细胞1 h,再用60μg·L^-1 IL-4处理6 h,随后将ASMCs与RAW264.7细胞共培养24 h。流式细胞术检测各组RAW264.7细胞中巨噬细胞表面标记蛋白CD86和CD206阳性细胞百分率,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组ASMCs培养上清液中白细胞介素10 (IL-10)水平,MTT法检测各组ASMCs增殖活性,流式细胞术检测各组ASMCs凋亡率。结果：细胞形态表现和免疫荧光染色结果证明所提取的细胞为ASMCs。RAW264.7细胞M2极化鉴定结果显示已诱导成为M...     

蒺藜总皂苷对H2O2诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的: 探讨蒺藜总皂苷(GSTT)对过氧化氢(H₂O₂) 诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12) 凋亡的保护作用及其机制。方法：PC12细胞分为对照组、模型组及蒺藜总皂苷高（GSTT₁）、低（GSTT₂）剂量组。用H₂O₂刺激PC12细胞使其发生凋亡,MTT法检测PC12细胞活性,流式细胞仪检测PC12细胞亚二倍体峰比率及线粒体膜电位的变化,免疫组织化学方法检测与凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax。结果：与模型组比较,蒺藜总皂苷组随着剂量的增加PC12细胞存活率提高（P<0.001),凋亡比率下降（P<0.01),线粒体膜电位回升（P<0.01),Bcl-2表达增加(P<0.05),而Bax的表达降低(P<0.05)。结论：蒺藜总皂苷可抑制H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与抑制线粒体途径的细胞凋亡有关。     

呼肠孤病毒导致白血病细胞凋亡的分子机制研究

  目的  初步探讨溶瘤病毒呼肠孤病毒3型(Reovirus 3,Reo3)致白血病HL60细胞凋亡的分子机制。  方法  用不同感染复数(MOI)的Reo3感染HL60细胞, 设未感染的HL60细胞为对照组,病毒感染48 h后,通过CCK8法检测不同MOI的病毒对HL60细胞活性的影响;利用流式细胞术检测HL60细胞凋亡率;Western blot检测HL60细胞中双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)活化水平和凋亡相关蛋白表达情况。用PKR特异性抑制剂2-氨基嘌呤(2-AP)作用HL60细胞24 h后,Reo3感染HL60细胞48 h,检测细胞凋亡水平和凋亡相关蛋白表达水平。  结果  MOI为1的Reo3作用于HL60细胞48 h后对细胞的抑制作用明显,细胞存活率为(24.333±3.396)%,细胞凋亡率为(29.96±2.06)%,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。Western blot结果显示:与对照组比较,感染Reo3的HL60细胞PKR、p-PKR、Bax、Caspase3、cleaved Caspase3蛋白表达均升高(P＜0.05),而Bcl-2蛋白表达水平下降(P＜0.05)。与未加抑制剂组比较,采用2-AP预处理的HL60细胞感染Reo3后细胞凋亡率下降(P＜0.05),PKR磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平亦下降(P＜0.05)。  结论  溶瘤病毒Reo3作用HL60细胞可以引起PKR的活化,导致HL60细胞的凋亡。     

丙泊酚激活线粒体凋亡通路诱导乳头状甲状腺癌TPC 1细胞凋亡和生长阻滞

【摘要】目的 探讨丙泊酚（PPF）通过线粒体凋亡通路对乳头状甲状腺癌TPC 1细胞凋亡和生长的影响。方法 分别采用0、12.5、25、50 μM丙泊酚处理TPC 1细胞,将细胞随机分为PPF 0 μM组、PPF 12.5 μM组、PPF 25 μM组和PPF 50 μM组进行后续实验。BrdU染色检测细胞增殖;克隆形成法检测细胞生长;流式细胞仪检测细胞凋亡;流式分选检测线粒体膜电位;蛋白免疫印迹检测Ki67、PCNA、Bcl 2、Bax、Caspase 3、Caspase 9、c Myc蛋白表达水平;试剂盒检测SOD、MDA、GSH含量。结果 与PPF 0μM组相比较,PPF 25 μM组和PDF 50 μM组BrdU阳性细胞数显著降低（P＜005）,克隆形成率显著降低（P＜005）,Ki67、PCNA蛋白水平显著降低（P＜005）,细胞凋亡率显著升高（P＜005）,细胞线粒体膜电位明显降低,Bax/Bcl 2、cleaved caspase 3/Caspase 3、cleaved caspase 9/Caspase 9比值显著升高（P＜005）,c Myc蛋白水平显著降低（P＜005）,SOD含量显著降低（P＜005）,MDA、GSH含量显著升高（P＜005）。结论 丙泊酚激活线粒体凋亡通路诱导乳头状甲状腺癌TPC 1细胞凋亡和生长阻滞。     

三七皂苷FC通过MAPK/NF-κB途径抑制RAW264.7细胞炎症及凋亡的机制研究

目的:基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)途径探讨三七皂苷FC对RAW264.7巨噬细胞炎症及凋亡的作用机制。方法:(1)采用不同浓度的三七皂苷FC(0、1、10、20、50、100μmol/L)分别干预RAW264.7细胞和脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,筛选合适的药物浓度。(2)将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组、LPS+三七皂苷FC低剂量(20μmol/L)组和LPS+三七皂苷FC高剂量(50μmol/L)组。先给予相应剂量的三七皂苷FC预处理6 h,再加入1μg/ml LPS。干预24 h后,PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)mRNA表达;Western blot检测TNF-α、iNOS、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光检测NF-κB核转位;Transwell实验检测细胞迁移。结果:(1)20、50μmol/L三七皂苷FC干预24 h后,LPS诱导的RAW264.7细胞活力较对照组无显著差异(P0.05),用于后续实验。(2)与LPS组相比,低、高剂量的三七皂苷FC作用后,TNF-α、IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01);TNF-α、iNOS蛋白表达明显降低(P0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比值显著下调(P0.05,P0.01);细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01);细胞核内NF-κB p65蛋白表达减少,阳性表达细胞数占比显著降低(P0.05);细胞迁移数显著减少(P0.01)。结论:三七皂苷FC能够显著改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,抑制巨噬细胞凋亡和迁移,其作用机制可能与下调MAPK/NF-κB通路磷酸化水平及抑制NF-κB核转位有关。     

日本血吸虫可溶性虫卵抗原诱导小鼠巨噬细胞增殖及TNF-α、TGF-β1的表达

目的探讨日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）对小鼠巨噬细胞株RAW264.7增殖及TNF-α、TGF-β1表达的影响。方法实验分三组：RAW264.7对照组、SEA组和细菌脂多糖（LPS）对照组。培养巨噬细胞株RAW264.7,用20μg/ml SEA分别作用巨噬细胞3、6、9、12和15 h后,荧光定量PCR检测炎症因子TNF-αmRNA和TGF-β1 mRNA的表达;倒置显微镜观察SEA作用12 h后巨噬细胞的形态;Western blot检测炎症相关蛋白TNF-α和TGF-β1的表达;MTT比色法检测SEA对细胞增殖的影响。结果 SEA作用RAW264.7细胞3 h起,TNF-αmR-NA和TGF-β1 mRNA的表达逐渐增高,在第12 h时,其相对表达倍数分别达23.07±3.172和9.83±1.45,与其他各时间点比较差异均有统计学意义（均P〈0.05）;SEA作用12 h巨噬细胞体积明显增大,细胞拉长且形态不规则;SEA作用巨噬细胞24、48、72 h时,A_（490）值分别与RAW264.7对照组相比,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）,而与LPS组的差异无统计学意义（P〉0.05）;在SEA作用RAW264.7细胞12 h时,TNF-α和TGF-β1蛋白表达均高于RAW264.7对照组（均P〈0.05）。结论 SEA能促进巨噬细胞的增殖并诱导TNF-α和TGF-ββ1的表达。     

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞凋亡的抑制作用

目的探讨结核分枝杆菌MPT64抗原对RAW264.7巨噬细胞的影响及相关机制。方法将MPT64基因在大肠杆菌中表达、纯化,获得的纯化蛋白用于后续实验。将用佛波醇酯(PMA)分化的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、卡介菌纯蛋白衍生物(BCGPPD)诱导组、BCG-PPD+MPT64共同作用组,分别给予相应的处理。孵育16 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用ELISA试剂盒检测培养细胞上清的细胞因子TNF-α及IL-10水平。结果 BCG-PPD可以诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,BCG-PPD+MPT64组的细胞凋亡水平低于BCG-PPD组(P<0.05)。细胞因子上清检测结果表明,与对照组相比,BCG-PPD作用组的TNF-α水平升高(P<0.01),而IL-10水平无明显变化;与BCG-PPD组相比,BCG-PPD+MPT64共同孵育组的IL-10水平升高(P<0.01),而TNF-α水平无明显变化。结论 MPT64抗原可能是一种毒力因子,能够抑制BCG-PPD诱导的巨噬细胞凋亡,该作用可能是通过提高IL-10水平来实现的。     

线粒体损伤在脂多糖诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）对血管内皮细胞凋亡的影响及线粒体损伤在其中的作用。方法：LPS刺激体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）后,采用CCK-8检测血管内皮细胞存活率,Western blot检测HUVECs细胞内Bax、Bcl-2、细胞色素C（cytochrome C,Cyt C）和Cleaved-caspase 3蛋白的表达,用流式细胞计数检测细胞的凋亡情况,用荧光探针Mitotracker、JC-1、Mito SOX染色检测细胞内线粒体形态及其膜电位的变化,以及线粒体来源活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生水平;用MitoTEMPOL+LPS干预细胞,检测Bax、Bcl-2、Cyt C蛋白表达以及凋亡。结果：LPS浓度依赖性降低细胞存活率（F=99.31,P=0.000）。与对照组相比,LPS可以明显诱导HUVECs细胞凋亡（t=17.184,P=0.000）,并呈浓度依赖性增加Cleaved-caspase 3（F=13.52,P=0.001）、Cyt C（F=21.008,P=0.000）和Bax（F=16.325,P=0.000）蛋白表达,并减少Bcl-2（F=17.287,P=0.000）蛋白的表达。LPS刺激后HUVECs细胞内线粒体发生明显的片段化和颗粒状变、线粒体膜电位下降（F=92.286,P=0.000）,线粒体来源的ROS产生明显增加（t=5.324,P=0.006）。采用线粒体ROS清除剂（MitoTEMPOL）处理,可抑制LPS刺激的HUVECs细胞Bax（F=19.854,P=0.002）和Cyt C（F=11.594,P=0.009）蛋白表达,增加Bcl-2（F=8.077,P=0.020）蛋白表达,同时降低Cleaved-caspase 3（F=15.941,P=0.004）蛋白表达和减少细胞凋亡（F=57.482,P=0.000）。结论：LPS可以诱导HUVECs细胞凋亡和线粒体损伤,损伤线粒体所释放的ROS可能在LPS诱导的血管内皮细胞凋亡的过程中发挥了重要的作用。     

黄芪注射液对阿霉素中毒性小鼠心肌细胞凋亡及细胞线粒体膜电位的影响

目的观察黄芪注射液对阿霉素中毒性小鼠心肌细胞凋亡及心肌细胞线粒体膜电位的影响。方法昆明小鼠60只,随机分为黄芪注射液治疗组（大、中、小剂量组）、阿霉素模型组和正常对照组,建立阿霉素中毒性心肌损伤模型,实验结束24 h后处死小鼠,取出心脏,应用流式细胞仪分析技术检测小鼠心肌细胞线粒体膜电位及心肌细胞凋亡百分率。结果（1）阿霉素模型组的心肌细胞线粒体膜电位小于其他各组（P＜0．05）;黄芪注射液各剂量组的心肌细胞线粒体膜电位小于正常对照组（P＜0．05）。（2）阿霉素模型组心肌细胞凋亡率高于正常对照组及黄芪注射液中、小剂量治疗组（P＜0．01）,但阿霉素模型组与黄芪注射液大剂量治疗组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论黄芪注射液可通过稳定细胞线粒体膜电位,抑制心肌细胞发生异常凋亡,保护心肌细胞。