人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得足够量的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１融合蛋白及含ＨＰＶ１６Ｌ１ＯＲＦ序列的基因重组体。方法：通过ＰＣＲ扩增获得ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１，表达后进行菌体蛋白质Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹分析。结果：ＨＰＶ１６Ｌ１基因重组体的构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中个有抗     

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 ＨＰＶ１６Ｌ１重组蛋白的表达为研制ＨＰＶ１６Ｌ１预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 ｐＰＬＣ３．５－ＨＰＶ;１６Ｌ１／ＧＳ１１５阳笥菌株,经０．５％甲醇诱导,运用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测Ｌ１蛋白;用鼠抗ＨＰＶ１６Ｌ１单克隆抗体,经Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测蛋白的特异笥;在透射电下观察类病毒颗粒（ＶＬＰｓ）结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明,在５５ＫＤ处有诱导蛋白带的出现;经Ｗ     

DIG—DNA探针检测宫颈癌组织中HPV—16的E7转化基因

应用地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ标记人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因作探针，分别检测了宫颈癌活检组织、宫颈炎及正常宫颈脱落细胞ＮＤＡ。其检率为：宫颈癌中４２．１％（２４／５７）、宫颈为中２．５％（１／３９）、正常宫颈中５．５％（１／１８）。宫颈组织中ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因的检出率较高，提示该转化基因与宫颈癌的发生可能密切相关。本研究也证实ＤＩＧ配基标记的Ｅ７基因探针具有特异、     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

HPV16E7基因克隆及其特异性鉴定

根据已报导的ＨＰＶ１６Ｅ７基因序列，设计了两个寡核苷酸引物，在引物的５’端分别引入了ＥｃｏＲＩ和Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切位点，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增了ＨＰＶ１６Ｅ７基因片段。通过ＥｃｏＲＩ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切位点与ｐＵＣ１８载体连接，重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９，在含Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ的平板上直接筛选，斑点杂交，ＰＣＲ扩增鉴定和酶切分析证明得到了含ＨＰＶ１６Ｅ７完整的编码序列的重组克隆。     

宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：进行人乳头瘤病毒１６型相关肿瘤的Ｅ６血清学研究。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从宫颈癌组织ＤＮＡ中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６基因片段,克隆至测序质粒ｐＧＥＭ－Ｔ中,并用限制性内切酶将ＨＰＶ１６Ｅ６基因切下,克隆至表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经ＩＰＴＧ诱导表达为融合蛋白,分子量约４５ＫＤ。结果：融合蛋白占菌体总蛋白的２５％,免疫印迹检测表明ＨＰＶ１６Ｅ６融合蛋白能被抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体识别。结论：     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7基因在体内和体外的表达

构建人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７湖北株（ＨＢ）基因真核表达质粒,探讨其在哺乳动物体外,体内表达状况,为本地区ＨＰＶ相关肿瘤的基因治疗提供依据。方法采用分子克隆技术,构建ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ重组表达质粒,磷酸钙－ＤＮＡ沉淀技术及基因免疫技术将外源目的基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞及大、小鼠体内ＰＣＲ,ＲＴ－ＰＣＲ,免疫荧光染色技术对外源目的基因及其产物（ｍＲ－ＮＡ,蛋白质。     

人乳头瘤病毒16型早期基因E7的克隆及其在原核细胞中的表达

目的 进一步研究与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因的生物学活性。方法 采用ＰＣＲ法从妇女宫颈癌标本中扩增ＨＰＶ１６早期基因Ｅ７,测人ＤＮＡ诉序列,结果 克隆的ＨＰＶ１６Ｅ７基因与标准型进行比较表明,前者无核苷酸突变。将此基因装入原核表达载体,能在Ｅ．Ｃｏｌｉ中高效表达出谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）－Ｅ７蛋白,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,此融合蛋白能在Ｅ７抗体特异地结合。结论     

人乳头瘤病毒16型E6基因表达产物单克隆抗体的制备研究

将含有人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ_（１６））Ｅ_６基因的重组质粒ＰＡＳ１－ＨＰＶ_（１６）Ｅ_６转染大肠杆菌ＡＲ１２０，在萘啶酮酸诱导下进行表达，表达产物经分离、纯化和鉴定获得一种分子量为１９０００的Ｅ_６表达蛋白。用纯化后的Ｅ６蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４在ＰＥＧ_（４０００）作用下进行融合，经ＨＡＴ培养基筛选杂交瘤细胞株，甲基纤维素半固体培养基克隆，克隆筛选，ＥＬＩＳＡ检测和再克隆，得到一株持续稳定分泌抗ＨＰＶ_（１６）Ｅ_６蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤株ＲＡＣ_６。     

HPV16 E_7基因克隆及其特异性鉴定

根据已报导的ＨＰＶ１６Ｅ_７基因序列，设计了两个寡核苷酸引物，在引物的５′端分别引入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增了ＨＰＶ１６Ｅ_７基因片段。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与ｐＵＣ１８载体连接，重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９，在含Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ的平板上直接筛选，斑点杂交，ＰＣＲ扩增鉴定和酶切分析证明得到了含ＨＰＶ１６Ｅ_７完整的编码序列的重组克隆。     

HPV16型E6C真核表达质粒的构建及其免疫小鼠后对T？…

目的：研究ＨＰＶ１６型Ｅ６早期蛋白Ｃ端编码区基因片段（Ｅ６Ｃ）免疫小鼠的作用。方法：利用基因重组技术构建含ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｃ的真核表达质粒，用此质粒肌肉注射免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，观察该疫苗对小鼠Ｔ细胞增殖的影响。结果：实验组小鼠Ｔ细胞与对照组相比增殖明显增强。结论：应用质粒能够诱导机体的细胞免疫反应增强，为乳头瘤病毒相关疾病的预防和治疗提供了思路。     

16型人乳头状瘤病毒E6、E7与宫颈癌、宫颈炎关系的初步研究

目的 了解重庆地区宫颈癌、宫颈炎发病与１６例人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ１６）Ｅ６、Ｅ７的关系。方法 运用ＰＣＲ,分子生物学技术进行ＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７的扩增和克隆。结果 重庆地区宫颈癌、宫颈炎组织中ＨＰＶ１６Ｅ６,Ｅ７总检出率分别为７０％和６５％。结论 重庆地区ＨＰＶ１６感染与宫颈癌、宫颈炎的发生相关。Ｅ７原癌蛋白可能与宫颈癌发生早期有关,而Ｅ６原癌蛋白可能与宫颈癌形成晚期关系密切。     

宫颈非典型增生组织中HPV16—DNA的定量PCR检测

（１）目的建立定量聚合酶链技术（ＰＣＲ）方法，检测宫颈组织中乳头瘤病毒１６型ＨＰＶ１６的基因含量。（２）方法通过重叠延伸ＰＣＲ构建一含ＥｃｏＲＩ酶切位点的内参照模板，用竞争性ＰＣＲ（ＣＰＣＲ）检测６例ＨＰＶ１６阳性宫颈非典型增生组织标本中ＨＰＶ１６Ｅ６，基因的拷贝数。结果６例阳性标本ＨＰＶ１６Ｅ６基因的拷贝数为每毫克ＤＮＡ中含１．９９×１０＾５～２．５０×１０＾７。（４）结论用ＣＰＣＲ检测宫颈组织     

人乳头瘤病毒6b型重组减毒沙门菌的构建及表达

目的：构建ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１Ｅ７嵌合基因重组减毒沙门菌，为进一步粘膜免疫奠定基础。方法：用ＰＣＲ方法扩增获得ＨＰＶ６ｂ　的　Ｌ１Ｅ７　嵌合基因片段，ＴＡ　克隆后，再将Ｌ１－Ｅ７　基因克隆入ｐＴＥＴｎｉｒ１５　沙门菌表达质粒。用电转化法将重组表达质粒导入鼠伤寒减毒沙门菌Ｓ．ＢＲＤ５０９（△ａｒｏＡ，△ａｒｏＣ）中，厌氧诱导其表达，蛋白样品做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　凝胶电泳　和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析。结果：用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切重组表达质粒ｐＴＥＴｎｉｒ１５６ｂＬ１Ｅ７可释放２３８９ｂｐ和１５５４ｂｐ两片段，结果与预计相符。ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示，重组沙门菌在约５６ＫＤ处有明显特异蛋白条带，而对照菌则无。结论：该重组沙门菌能特异地表达ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７　融合蛋白，人乳头瘤病毒ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７重组减毒沙门菌构建成功。     

HPV16、HPV18感染及p53蛋白过度表达与肺癌的相关性研究

为研究人乳头瘤病毒１６和１８型（ＨＰＶ１６和ＨＰＶ１８）感染及ｐ５３基因突变与肺癌的关系，应用经病理学证实的肺癌活组织，行聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测癌组织中的ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８；并用ＬＳＡＢ免疫组化法检测相应蜡块标本中ｐ５３蛋白的过度表达。在４８例肺癌组织标本中未检出ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８；ｐ５３蛋白表达呈阳性，阳性率为５４．２％（２６／４８），其中鳞癌６６．７％（１８／２７），腺癌５７．１（４／７），小细胞癌３３．３％（１／３），大细胞癌３３．３％（２／６），类癌２０．０％（１／５）。提示肺癌的发生可能与ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８感染无关，而与ｐ５３基因突变有关，尤以与鳞癌和腺癌关系密切     

子宫颈鳞癌 Rb 基因与 HPV16 E7 基因的相关性研究

用多聚酶链反应—单链构象多态性分析（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）以及地高辛标记探针斑点杂交技术对３０例子宫颈鳞癌组织中Ｒｂ抑癌基因及ＨＰＶ１６Ｅ７癌基因进行分析。结果３０例子宫颈鳞癌组织中未检出Ｒｂ基因突变或缺失；２０例癌组织中检出ＨＰＶ１６Ｅ７ＤＮＡ，阳性率为６７％。提示ＨＰＶ１６Ｅ７癌基因与子宫颈鳞癌密切相关。子宫颈鳞癌中Ｒｂ基因结构异常并不常见，而且与ＨＰＶ１６Ｅ７基因的存在状况无明显相关性。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的：探讨用人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）早期基因Ｅ６羧基端基因片段（Ｅ６Ｃ）研制ＤＮＡ疫苗的可行性。方法：采用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＰＶ１６中获得Ｅ６Ｃ端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染ＬＡ７９５小鼠肺腺癌细胞并检测Ｅ６Ｃ的表达。结果：成功构建了真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ,免疫组化结果显示真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ在ＬＡ７９５细胞中获得有效表达。