霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化

[目的]建立一种快速检测样品中霍乱弧菌的多重PCR方法,优化霍乱弧菌多重PCR的反应体系和循环参数.[方法]根据霍乱毒素ctxA、toxR、O139群特异性基因、O1群特异性基因序列,设计特异性引物,对引物浓度、PCR缓冲液的浓度、Mg2+浓度、退火温度及其延伸时闻等条件进行优化.[结果]4对引物在不同血清型霍乱弧菌DNA模板中能特异扩增出不同的条带.在同一反应体系中,较低的延伸温度可以提高霍乱弧菌多重PCR检测的灵敏度.[结论]通过对霍乱毒素多重PCR反应体系不同因素的优化,建立了稳定可靠的霍乱弧菌多重PCR检测平台.     

结核分枝杆菌高特异性MB-PCR体系优化及荧光检测研究

目的设计结核分枝杆菌高特异性分子信标探针及优化TB-MB-PCR体系,尝试运用荧光分光光度计观测反应后的荧光信号。方法运用软件Beacon designer设计分子信标探针,优化TB-MB-PCR反应体系各组份浓度,运用荧光分光光度计观测反应后的荧光信号。结果优化后的MgCl2、引物、dNTP以及MB在PCR反应体系中的最佳终浓度分别为4mmol/L、0.04μmol/L、0.2mmol/L以及0.04～0.05μmol/L;3种稀释标本TB-MB-PCR阳性产物、TB-MB-PCR阴性产物;TB-PCR阴性产物（空白对照）的荧光信号差异明显。结论高特异性分子信标探针设计较理想、优化后的TB-MB-PCR反应体系灵敏性、特异性好;荧光分光光度仪可直接检测反应产物,有简单、灵敏、准确等优点。     

多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因的研究

[目的]建立一种快速、高效地检测金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEC和SED基因的多重PCR法并进行优化. [方法]试剂盒提取产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板,根据SEA、SEB、SEC和SED肠毒素基因片段保守区序列设计引物,多重PCR扩增产肠毒素金黄色葡萄球菌基因组中特异靶序列.对反应体系Mg2+浓度、引物浓度和退火温度进行优化,并初步检测方法特异性. [结果]在PCR反应体系中加入设计的4对引物可同时扩增出金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因中的特异序列;在总体积为25 μl的反应体系中,最优Mg2+浓度为2.0 mmol/L,引物浓度分别为0.2 μmol/L,退火温度为49℃;以大肠杆菌O157:H7和肠炎沙门菌510041基因组DNA为模板扩增不出特异片段. [结论]成功建立金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因多重PCR法,该法能快速、高效地同时检测SEA、SEB、SEC和SED基因,比传统PCR方法省时省力,可以弥补传统PCR法的不足.     

RAPD-PCR技术筛选间日疟原虫基因标记

目的建立并优化间日疟原虫RAPD-PCR方法，筛选间日疟基因标志。方法采集5例间日疟病人、4例非间日疟病人和5名健康者血样并提取DNA，用随机引物进行RAPD-PER扩增、改变各项反应条件进行RAPD-PER方法的优化，10条不同的随机引物（S60-S69）检测各种血样并筛选间日疟特异性扩增条带。结果在MgCl2浓度为2．0mmol／L、dNTP浓度为150μmol／L、引物浓度为0．2μmol／L、TaqDNA聚合酶为1U和36℃的退火温度时进行RAPD-PCR扩增效果最好。所用10条随机引物中的S62、S65、S69在检测血样中分别筛选出3、1、1条间日疟所仅有的扩增条带。结论在优化的反应条件下，RAPD-PCR方法的稳定性、重复性好。筛选出3条随机引物获得5条间日疟仅有的RAPD-PER扩增条带。     

Mg2+浓度在多基因PCR中关系的研究

目的：通过实验介绍游离性Mg^2 在不同浓度情况下对Tag酶活性及MgCl2作为一种盐对多基因PCR的影响过程。方法：利用不同Mg^2 浓度的缓冲液及不含KCl的不同Mg^2 浓度的缓冲液来研究其对多基因PCR的影响。结果：Mg^2 是Tag酶活性所必需的，Mg^2 浓度过低时，Tag酶活性显著下降，无特异条带扩增或特异条带扩增不明显。在Mg^2 浓度高时，Tag酶活性增强，非特异条带扩增。随着Mg^2 浓度的增加，在接近10mmol/L时，扩增条带亮度减弱，非特异扩增条带减少。结论：在无KCl存在，单一Mg^2 影响反应的情况下，随着Mg^2 浓度的过度增加，高浓度的Mg^2 抑制了Tag酶活性，从而减少了产物的数量，在50mmol/L Mg^2 浓度时完全抑制了扩增。     

环介导等温扩增快速检测人类嗜T淋巴细胞病毒I型方法建立

[目的]建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测人类嗜T淋巴细胞病毒I型方法. [方法]将HTLV-I的PX基因转染pUC57构建HTLV-I检测参考菌株,针对PX基因设计LAMP和PCR引物,用正交实验设计优化反应体系,并考察方法的特异性和灵敏度. [结果]25μl LAMP最佳反应体系为:外引物02 μmol/L、内引物1.8 μmol/L、dNTP 2 000 μmol/L、Mg2+4 mmol/L、甜菜碱0.4 mol/L、BstDNA聚合酶8 U;最佳反应条件为64℃恒温反应60min.[结论]LAMP方法具有灵敏、特异、操作简便、成本低廉的特点,可为HTLV-I的快速检测提供新手段.     

葡萄球菌染色体mec盒多位点复合PCR分型测定

目的研究用多位点复合PCR分型法高效、快速、准确地测定金黄色葡萄球菌SCCmec型别。方法采用正交设计和平行对比分析,对影响测定结果的退火温度、延伸时间,MgCL2、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物的用量进行了测试。结果获得多位点PCR测定的最佳退火温度为55℃、延伸时间为1 min,以及MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶和各位点引物的最佳用量。结论多位点PCR测定是一种高效、快速、实用的SCCmec分型方法,可用于大规模的MRSA分子流行病学研究。     

利用正交设计优化脑膜炎奈瑟氏菌Taqman-MGB探针检测反应体系

[目的]建立Taqman-MGB探针检测脑膜炎奈瑟氏菌的最佳反应体系,探讨影响Taqman-MGB探针检测的多个因素.[方法]利用正交设计,从Buffer、 Taq DNA聚合酶、引物、Mg2 、探针、dNTP 6种因素对实时荧光PCR体系进行优化,在此基础上,进一步细调,寻求实时荧光PCR反应的最佳反应体系.[结果]正交试验结果表明,最佳反应体系为(50μl): Mg2 7.0mmol/L,引物0.6μmol/L, dNTP 300μmol/L, Taq DNA聚合酶2.0U,探针0.1μmol/L, Buffer 1.5×.[结论]Md2 是影响实时荧光PCR的重要因素;所得体系反应稳定,正交法实验设计高效、快捷,科学性强,值得推广.     

在多基因PCR中对dNTP与Mg^2＋的浓度关系的研究

目的　通过实验介绍在单一浓度下的Mg2 与在不同浓度情况下的dNTP及在单一浓度下的dNTP与在不同浓度下的Mg2 进行多基因PCR的反应过程。方法　通过多基因PCR分析比较Mg2 和dNTP在不同浓度下的反应结果。结果　PCR反应在 10×PCRBuffer为 0 0 2mol/LMg2 浓度时 ,随着dNTP浓度的增大 ,PCR反应增强 ,特别是较大片段PCR产物反映更为明显。但随着dNTP浓度的继续增大 ,PCR反应抑制 ,扩增条带度减弱 ,直至条带完全消失。而在0 0 0 2mmol/LdNTP浓度下 ,随着Mg2 浓度的不断增大 ,反应逐渐增强。但随着Mg2 浓度的继续增大 ,扩增条带亮度有减弱趋势。结论　在Mg2 单一浓度下 ,较大浓度dNTP有增强条带亮度的作用 ;在dNTP单一浓度下 ,过高的Mg2 浓度能抑制反应。     

在多基因PCR中对dNTP与Mg2+的浓度关系的研究

目的通过实验介绍在单一浓度下的Mg2+与在不同浓度情况下的dNTP及在单一浓度下的dNTP与在不同浓度下的Mg2+进行多基因PCR的反应过程.方法通过多基因PCR分析比较Mg2+和dNTP在不同浓度下的反应结果.结果PCR反应在10×PCRBuffer为0.02mol/LMg2+浓度时,随着dNTP浓度的增大,PCR反应增强,特别是较大片段PCR产物反映更为明显.但随着dNTP浓度的继续增大,PCR反应抑制,扩增条带度减弱,直至条带完全消失.而在0.002mmol/LdNTP浓度下,随着Mg2+浓度的不断增大,反应逐渐增强.但随着Mg2+浓度的继续增大,扩增条带亮度有减弱趋势.结论在Mg2+单一浓度下,较大浓度dNTP有增强条带亮度的作用;在dNTP单一浓度下,过高的Mg2+浓度能抑制反应.     

肺癌易感性与4种代谢酶基因多态性关系的研究

目的 探讨4种代谢酶基因多态性与肺癌易感性的关系.方法 采用病例对照研究的方法,209例肺癌患者为病例组,256例健康体检者为对照组,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测Ⅰ相代谢酶基因细胞色素P450 1A1 (CYP1A1),Ⅱ相代谢酶基因谷胱甘肽S-转移酶M1 (GSTM1)、谷胱甘肽S-转移酶T1 (GSTT1)及环氧化物水化酶(mEH)基因的多态性.结果 CYP1A1基因Ⅱe462Val位点纯和突变型、GSTM1缺失型、mEH基因Tyr113His位点纯和突变型在病例组与对照组中的分布频率差异均有统计学意义(P＜0.05),这3种变异基因型携带者与野生型携带者相比发生肺癌危险度分别为1.968倍(OR=1.968,95％CI 1.197～3.236)、1.775倍(OR=1.775,95％CI1.226～2.568)、1.983倍(OR=1.983,95％CI 1.260～3.121).CYP1A1基因Msp1位点、GSTT1及mEH基因His139Arg位点多态基因型在病例组与对照组中的分布频率差异均无统计学意义(P＞0.05).Logistic多元回归分析表明CYP1A1Ile462Val突变基因型与GSTM1缺失型、CYP1A1 Ile462Val突变基因型与mEH Tyr113His突变基因型之间在肺癌的发生中具有交互作用,这两种联合基因型携带者患肺癌的危险度分别为4.86、3.27 (P＜ 0.05).结论 代谢酶基因变异及基因间的交互作用与肺癌患癌危险度增高有关,其在肺癌的发生过程中起一定作用.     

河南省人群五种基因多态性与肺癌易感性的关系

目的探讨河南省人群中外源性化合物代谢酶CYP1A1、GSTM1、GSTT1、mEH和DNA修复酶XRCC1基因多态性与肺癌易感性的关系。方法采用病例-对照研究的方法,选取河南省209例肺癌患者为病例组,256例健康体检者为对照组,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测I相代谢酶基因CYP1A1,II相代谢酶基因GSTM1、GSTT1、mEH及DNA修复酶基因XRCC1的多态基因型。结果河南省人群中GSTM1缺失型,CYP1A1-exon7、mEH-exon3、XRCC1-194及XRCC1-280基因纯和突变型在病例组与对照组中的分布频率差异均有统计学意义(P<0.05),GSTM1基因缺失者与GSTM1基因阳性者相比发生肺癌的危险性升高(ORadj=1.76,95%CI:1.21-2.56,P=0.005);携带CYP1A1-exon7 Ile/val+val/val基因型的个体较携带CYP1A1-exon7 Ile/Ile基因型的个体发生肺癌的危险性升高(ORadj=1.65,95%CI:1.16-2.39,P=0.009);mEH-exon3突变基因型携带者与野生纯合型的个体相比发生肺癌的危险性升高(ORadj=1.77,95%CI:1.18-2.64,P=0.007);携带XRCC1-194 Arg/Trp+Trp/Trp基因型的个体较携带XRCC1-194 Arg/Arg基因型的个体发生肺癌的危险性升高(ORadj=1.55,95%CI:1.07-2.27,P=0.016);XRCC1-280 His/His基因型携带者较XRCC1-280 Arg/Arg+Arg/His基因型携带者发生肺癌的危险性升高(ORadj=2.21,95%CI:1.05-4.52,P=0.026)。CYP1A1-Msp1、GSTT1、mEH-exon4及XRCC1-399多态基因型在病例组与对照组中的分布频率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论河南省人群中CYP1A1、GSTM1、GSTT1、mEH和XRCC1基因的分布与国内外相关报道有一定差异,其中CYP1A1-exon7、GSTM1、mEH-exon3、XRCC1-194及XRCC1-280基因位点的变异与河南省人群肺癌患癌危险度增高有关。     

代谢酶基因多态性与结直肠癌的易感性

目的研究代谢酶细胞色素P450（cytochrome P450s,CYP）1A1、谷胱甘肽转移酶（glutathione—S-transferase,GST）M1和T1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDPglucumnosyltransferase,UGT）1A7基因多态性与结直肠癌的易感性及其交互作用。方法2002年5月在浙江省嘉善县开展的现场病例对照研究及单纯病例研究,获得140例结直肠癌患者和343名健康对照,用PCR-限制性片段长度多态性等方法检测CYP1A1、GSTM1、GSTT1和UGT1A7的基因多态,并应用非条件logistic回归方法进行数据分析。结果CYPIA1 MspI多态（非编码区T6235C）C／C基因型、T／C和C／C基因型者相对于T／T基因型者的OR值分别为0．493（95％CI：0．254—0．956）和0．638（95％CI：0．427—0．952）,具有统计学意义;GSTM1、GSTT1非缺陷型与缺陷型的分布频率对照组和病例组比较差异无统计学意义;对照组和病例组UGT1A7变异／变异型基因与野生纯合型基因比较差异有统计学意义（OR=2．501,95％CI：1．456—4．296）。单纯病例研究分析,CYP1A1与GSTT1、GSTM1与GSTT1对结直肠癌的发生存在交互作用,COR值分别为2．617（95％CI：1．015—6．752）和3．935（95％CI：1．323—11．706）;而CYPlAl与GSTM1、CYP1A1与UGT1A7之间无交互作用。结论CYP1A1 MspI变异型可降低机体对结直肠癌的易感性,而UGT1A7的变异／变异基因型可增加结直肠癌的罹患风险,CYP1A1与GSTT1、GSTM1与GSTT1对结直肠癌的发生存在交互作用。     

中国汉族人口三种谷胱甘肽S-转移酶基因多态性分析

目的：分析中国汉族人口谷胱甘肽S－转移酶（GSTs)基因多态性分布。方法：样本为450名中国汉族人口,采用多重等位基因特异聚合酶链反应（PCR）方法分析GSTM1和GSTT1基因多态性,采用PCR－限制性片段长度多态性方法分析GSTP1＋313核苷酸位点的基因多态性。结果：GSTM1缺失型和GSTT1缺失型基因型频率分别为57％和45％,同时具有GSTM1缺失型和GSTT1缺失型基因型的人个体频率为28．92％;而GSTP1＋313位点G等位基因频率为18．7％,并发现该人群中同时具有3种危险基因型（GSTM1缺失型、GSTT1缺失型和GSTP1＋313A／A）的个体频率为18．04％。GSTs基因型分布不受性别和年龄的影响。结论：中国汉族人口GSTM1、GSTT1和GSTP1基因呈多态性分布,其等位基因和基因型频率不同于其他种族。     

GSTT1及CYP1A1基因多态性与肺癌易感性关系

目的 探讨细胞色素P4501A1(CYP1A1)和谷胱甘肽硫转移酶T1(GSTT1)基因多态性与肺癌易感性的关系.方法 用等位特异性PCR(AS-PCR)及多重PCR技术分析106例肺癌患者和250名健康人的CYP1A1、GSTT1基因多态性、基因型分布频率和交互作用.结果 携带CYP1A1(Val/Val)/GSTT1(-)基因型的人患肺癌的风险明显增加(P=0.025);吸烟与肺癌易感性有关(P=0.037),吸烟者患肺癌的风险明显增加(OR=1.628.95%CI=1.028～2.577);携带CYP1A1(Val/Val)基因的吸烟者较携带CYP1A1(Ile/Ile)基因型的不吸烟者易患肺癌(P=0.033);携带GSTT1(-)的吸烟者患肺癌的风险明显增加(P=0.045).结论 CYP1A1突变型和GSTT1(-)基因型是肺癌的可疑易患因素,二者对肺癌的发生有协同作用,但单独携带CYP1A1突变型或GSTT1(-)基因型肺癌易感性差异无统计学意义,吸烟与肺癌易感性有关;CYP1A1突变型、GSTT1(-)基因型与吸烟在肺癌的发生上有相互促进作用.     

母亲和新生儿GSTM1、GSTT1和细胞色素P_(450)1A1基因多态性与早产易感性关系

目的探讨母亲和新生儿GSTM1、GSTT1基因以及细胞色素P4501A1基因多态性对早产的影响。方法采用病例-对照调查方法,应用多重PCR和限制性内切酶PCR(RFLP-PCR)技术对早产母亲和对照母亲以及早产新生儿和对照新生儿GSTM1、GSTT1基因和CYP1A1基因MSPI位点多态性分别进行检测。结果GSTM1、GSTT1基因和CYP1A1基因MSPI位点多态性在早产母亲和对照母亲组中没有显著性差异(P>0.05);以上基因在早产新生儿和对照新生儿组中也没有显著性差异(P>0.05)。GSTM1与GSTT1联合基因型在母亲和新生儿的病例与对照组中也没有显著性差异(P>0.05);GSTT1缺失型和CYP1A1变异型联合基因在早产母亲组与对照母亲组中有显著性差异(χ2=4.683,P<0.05,OR=2.440)。结论携带GSTT1缺失型基因以及CYP1A1变异型基因的母亲,其发生早产的危险性增大。     

GSTT1及GSTM1和CYP2E1基因多态性与二甲基甲酰胺所致肝脏损害的关系

目的 探讨GSTT1、GSTM1和CYP2E1基因多态性与二甲基甲酰胺(DMF)作业人员肝脏损害的关系.方法 以某皮革厂69名肝功能异常的DMF作业人员为病例组,选取与病例组相似岗位、DMF接触水平相近而肝功能正常的125名工人为对照组,应用聚合酶链反应(PCR)、PCR-RFLP方法分别对GSIT1、GSTM1和CYP2E1 PstI位点基因进行分型.结果 病例组和对照组中GSTM1阳性和GSTM1阴性的分布频率分别为59.42%、38.40%和40.58%、61.60%,两组间分布的差异有统计学意义(P=0.005),携带GSTM1阳性基因型个体发生肝功能异常的风险是GSTM1阴性基因型个体的2.34倍(OR=2.34,95%CI:1.29～4.29).而GSTT1和CYP2E1 PstI位点不同基因型在病例组和对照组中没有明显差异.结论 携带GSTM1阳性基因型个体的DMF作业人员发生肝功能异常的风险性可能增加.     

GSTT1基因、GSTM1基因多态性与乳腺癌易感性的病例-对照研究

目的探讨女性乳腺癌人群中,雌激素代谢酶GSTT1基因、GSTM1基因多态性与乳腺癌易感性的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)对天津市105例正常对照者和100例乳腺癌患者的GSTT1基因、GSTM1基因多态性进行检测,Logistic回归分析评估单个、联合基因以及雌激素暴露相关因素对罹患乳腺癌的危险度。结果GSTT1基因缺失型在两组间分布频率的差别有统计学意义(χ2=13.766,P=0.000),GSTM1基因在两组间分布频率的差别有统计学意义(χ2=13.135,P=0.000);联合基因型分析显示,随着GSTT1或GSTM1基因型缺失情况的出现,个体罹患乳腺癌的危险性增加(趋势性检验,χ2=27.011,P=0.000);GSTM1基因和GSTT1基因同时缺失的人群OR(95%CI)为12.338(3.621～22.042);多因素非条件Logistic回归分析结果显示:GSTT1基因和GSTM1基因缺失与乳腺癌的发生相关。结论雌激素代谢酶相关基因多态性与乳腺癌发生相关。     

Role of metabolic polymorphisms in lung carcinogenesis]

Metabolism of most chemical carcinogens in humans is thought to occur in two distinct phases. The carcinogens exert their effect only after being metabolically activated to intermediates (phase I), which are capable of binding to DNA and causing mutations. The most ubiquitous phase I catalysts are the cytochrome P450s (CYPs). There is convincing epidemiological evidence that lung cancer risk associated with polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) is mediated in part by aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH), which is used as an indicator of the phenotype of CYP1A1. Since AHH is responsible for the activation PAHs in cigarette smoke, it may be important in the causation of lung cancer. Kellermann et al. reported a significant positive correlation between AHH inducibility and susceptibility to lung cancer. The finding, however, has been both supported and refuted by subsequent investigators. Advances in molecular biology have allowed many allelic variants of several drug metabolizing enzymes so that individuals with the susceptible genotypes can be determined easily. A close association between development of lung cancer and homozygous rare genotypes in MspI and Ile-Val polymorphisms of CYP1A1 gene has been recently reported in some Japanese populations. The association between GSTM1 polymorphism and lung cancer risk is not so strong, however. Following the phase I reaction, phase II enzymes such as glutathione S-transferases (GSTs) are responsible for detoxification of activated forms PAH-epoxides. GSTs form a superfamily of genes consisting of four distinct families, named Alpha, Mu, Pi and Theta. The GSTM1, GSTT1 and GSTP1 genes are polymorphic in humans. The phenotypic absence of GSTM1 activity is due to a homozygous inherited deletion of the gene, the null genotype. The homozygous deletion of GSTM1 genes has been shown to occur in approximately 50% of the populations of various ethnic origins. The GSTM1 null genotype confrs a moderately increased risk of smoking-related lung cancer, however. Genetically determined susceptibility to lung cancer may depend on the metabolic balance between phase I and phase II enzymes. Risk of lung cancer, especially squamous cell carcinoma is shown to be remarkably increased in individuals with a combination of a homozygous rare allele of the CYP1A1 gene and the nulled GSTM1 gene, compared with those having other combinations of genotypes. Individuals with susceptible genotypes may become important for the prevention of lung cancer.     

毒物代谢酶基因多态性与胃癌易感性

简要综述毒物代谢酶一相酶细胞色素P4502E1（CYP4502E1）、二相酶谷胱甘肽S－转硫酶M1、T1GSTM1、GSTT1）、N－乙酰化转移酶（NAT）的基因多态性与胃癌的遗传易感性的国内外研究进展。