一种新型机械应变细胞加载装置的研制

目的 研究开发一套具有自主知识产权的数控机械应变细胞加载装置,为细胞力学研究提供必要的研究手段.方法 加载装置基于圆形基底形变技术,采用数字式测控系统和基于PC机平台的专用软件,实现对体外培养细胞加载牵张应变.采用MTT比色实验检测人牙周膜细胞在弹性硅橡胶细胞培养膜上的附着生长能力.采用该装置对体外培养人牙周膜细胞加载1％、10％、20％拉伸应变0.5、1和24h,倒置相差显微镜观察细胞形态、排列的变化.结果 数控机械应变细胞加载装置可对体外培养细胞加载不同强度、频率和时间的拉伸应变,具有输出应变范围大、精度高、操作方便、显示直观等优点.硅橡胶膜和对照细胞培养板接种细胞1、2、4、7、8d后,MTT比色实验光吸收值之间无统计学差异(P＞0.05),显示弹性硅橡胶膜具有良好的细胞附着生长能力.人牙周膜细胞加载10％、20％拉伸应变24h后,细胞形态、排列发生改变,胞体呈长梭形,并成栅栏状平行排列,细胞长轴垂直于拉伸应变方向.结论 数控机械应变细胞加载装置可有效地对体外培养细胞加载动态机械拉伸应变,为体外细胞力学研究提供了必要的研究手段.     

不同波形的周期性机械拉伸对人肺腺癌细胞株A549增殖的影响

目的研究不同波形的周期性机械拉伸对人肺腺癌细胞株A549增殖的影响。方法应用Flexercell4000加载系统对拉伸应变下细胞增殖动力学变化进行分析。结果在应变为15%,频率为30次/min,加载时间为2h下,不同波形的拉伸刺激对细胞增殖的影响不同。其中方波组细胞生长明显受抑。结论施加方波的周期性机械拉伸可能对肺腺癌细胞增殖有抑制作用。     

周期性应变对血管平滑肌细胞形态和生长的影响

目的:研究周期性应变条件下血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)形态和生长的变化.方法:利用脉动膜式张应力系统,给VSMCs施加周期性应变,运用相差显微镜、计算机图像捕获系统及图像处理分析软件观察和分析VSMCs的形态变化;用3HTdR掺入率测定法检测VSMCs的DNA合成变化.结果:VSMCs承受14%的周期性应变后,细胞发生重排并与应力加载方向垂直,细胞形态指数减小,铺展面积、周长、细胞长轴在加载6h时明显增加,12～24h逐渐减小并趋向于稳定.8%的周期性应变抑制VSMCs生长和DNA合成;14%的周期性应变使VSMCs生长和DNA的合成明显增加,24h和48h时其DNA合成分别是对照组的1.4和1.8倍.结论:周期性应变不但影响VSMC的形变,且会导致VSMCs的重排.近生理条件下的周期性应变抑制VSMCs的生长,超生理范围的应变促进VSMCs的生长.     

不同拉伸力加载培养对人血管内皮细胞增殖情况的影响和意义

目的 探讨外在不同强度机械拉伸力加载对体外培养人血管内皮细胞生长的影响和相关生长因子的表达情况,以及其在临床负压治疗中的指导意义.方法 对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞加载不同拉伸力干预,实验分6组,分别加载FX-5000T应力系统不同大小拉伸力(拉伸度分别为0、5%、10%、15%、20%、30%)后,利用CCK-8 法检测细胞增殖情况,qRT-PCR检测血管形成因子相关基因VEGF、Flk-1、Tie-2 表达水平,提取相关蛋白 WB检测Flk-1、Tie-2 蛋白表达水平.结果 各应力加载培养组细胞活性下降,且应力越高细胞活性越低;各应力组细胞内VEGF、Flk-1、Tie-2基因的表达呈不同程度下调趋势,且应力越高,VEGF、Flk-1、Tie-2的表达越低;各应力组细胞内Flk-1、Tie-2的蛋白表达呈下调趋势,且呈现一定的剂量依赖性,即应力越高,Flk-1、Tie-2的蛋白表达越低.结论 外在拉伸力对人血管内皮细胞生长增殖有一定影响,且长时间超生理范围的拉伸力对人血管内皮细胞的增殖有明显抑制作用.     

冠状血管平滑肌细胞发生机制的研究进展

冠状血管为心脏提供营养及氧供,对心脏的正常工作至关重要。冠状血管的管壁主要由平滑肌细胞及内皮细胞构成,平滑肌细胞的结构和功能对冠状血管及心脏的正常工作有重要影响。控制细胞分化、迁移及平滑肌前体细胞数量的分子通路决定了冠状血管的结构及容量。这些信号通路的异常会导致血管畸形,故了解这些机制有益于利用前体细胞进行体内细胞重排从而诱导血管再生。     

胆汁对血管平滑肌细胞作用的实验研究

目的观察胆汁对离体血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）的作用，探索经颈静脉肝内门腔静脉分流术后狭窄的形成原因。方法用离体细胞培养法，将平滑肌细胞放入有不同浓度胆汁的培养液中培养。在３、１０、１４ｄ收获细胞，每一收获点中每组为６个样本。检测脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）和总蛋白含量。结果此前预试验２．５％、５．０％、１０．０％胆汁培养基，ＳＭＣ在３ｄ内全部死亡。离体细胞培养（１．０％胆汁）实验组中的ＤＮＡ和总蛋白量明显较对照组少（Ｐ＜０．０５），且随培养时间延长其差异增加。结论２．５％～１０．０％胆汁能杀死ＳＭＣ，１．０％胆汁可抑制ＳＭＣ生长。     

介绍一种离体血管环的实验装置和方法

目的：介绍一种离体血管环的实验装置和方法。方法：通过心桥软件将血管环的等长张力和内壁周长数据绘成长度－张力曲线，据此将血管环拉伸至最适长度后进行实验。结果：本实验装置和方法稳定、可靠、准确、灵敏。结论：这套装置能够更准确地反映血管的特点，可用于各种血管环实验。     

胆汁对血管平滑肌细胞作用的实验研究

观察胆汁对离体血管平滑肌细胞的作用，探索经颈静脉肝内门腔静脉分流术后狭窄的形成原因。方法用离体细胞培养法，将平滑肌细胞放入有不同浓度胆汁的培养液中培养。在３，１０，１４ｄ收获细胞，每一收获点中每组为６个样本。检测脱氧核糖核酸和总蛋白含量。结果此前预试验２．５％，５．０％，１０．０％胆汁培养基，ＳＭＤ在３ｄ内全部死亡。     

机械拉伸对人肺上皮细胞粘附及[Ca2+]i的影响

目的探讨周期性拉伸应变对人肺上皮细胞H727的力学性质及其[Ca2 ]i的调控作用.方法应用微管吸吮系统测定细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积,用荧光探针Fluo-3/AM测定拉伸应变对人肺上皮细胞H727[Ca2 ]i的影响.结果在应变为15%,频率为40次/min的拉伸刺激下,与其静态对照组相比,细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积均增加;拉伸5 min后,[Ca2 ]i比对照组有明显增加,用三七总皂苷阻断胞内Ca2 离子通道后,细胞对应变的响应仍表现出[Ca2 ]i的升高,但与未加三七总皂苷的实验组相比,[Ca2 ]i响应应变后的升高由原来的3.4倍的增加降低为1.5倍的增加.结论在人肺上皮细胞H727响应周期性拉伸应变的过程中,[Ca2 ]i的升高既有胞外钙内流的参与,也有胞内钙库的释放作用,其中胞外钙通过跨膜通道的内流起主要作用.     

AT_2受体cDNA重组质粒转染入培养的大鼠VSMC

目的 :将构建的AT2 RcDNA重组质粒转染到培养的大鼠血管平滑肌细胞 ,为研究AT2 R对血管平滑肌细胞生长的影响提供实验基础。方法 :扩增、纯化重组质粒后 ,用脂质体介导法将重组质粒转染入培养的大鼠血管平滑肌细胞 ,分别用AT2 RmRNA原位杂交、AT2 R抗体免疫组化的方法从RNA和蛋白水平检测转染效果。结果 :原位杂交显示部分细胞浆棕黄色阳性反应 ,显示转染率为 9% ,免疫组化结果显示部分血管平滑肌细胞膜上有AT2 R蛋白存在。结论 :成功将AT2 RcDNA重组质粒转染到培养的大鼠血管平滑肌细胞中。转染后AT2 R能在大鼠主动脉平滑肌细胞表达的现象为进一步研究AT2 R对成年大鼠血管平滑肌细胞生长、凋亡的影响提供了实验基础     

动态牵张应变对人牙周膜细胞的细胞骨架的影响

目的 研究动态牵张应变下人牙周膜细胞（HPDLCs）细胞骨架的变化。方法 体外培养HPDLCs,利用动态牵张应变细胞加载装置对HPDLCs分别加载1%、10%和20%的牵张应变,每种应变分别加载7个时间段（0.5、1、2、4、6、12、24 h）,应用激光共聚焦显微镜观察HPDLCs细胞骨架的形态结构;收集图像并运用Image-Pro Plus 4.5.0.29软件进行分析,测定HPDLCs的面积、长度与宽度比（长宽比）以及细胞骨架蛋白F-actin的积分荧光强度。结果 激光共聚焦显微镜观察发现：随着加载牵张应变的作用时间延长和应变值提高,HPDLCs细胞逐渐呈现栅栏状相互平行排列趋势,且排列方向垂直于牵张力方向,胞体被拉长。图像分析结果显示：加载动态牵张应变后,HPDLCs的细胞面积、长宽比及F-actin的表达量均发生相应的变化。结论 动态牵张应变可引起HPDLCs细胞骨架的变化,并且与施加应变的大小和应变作用时间有关。     

胰腺干细胞与胰岛混合培养对其转化率的影响

目的  研究胰腺干细胞与胰岛混合培养对增加胎鼠胰腺干细胞向β前体细胞转化率的作用及机制。 方法  实验分为胰腺导管干细胞单独培养组（Ⅰ组）,胰岛单独培养组（Ⅱ组）及干细胞-胰岛混合培养组（Ⅲ组）。V型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后,使用Ficoll-400梯度离心法纯化胰岛;采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺干细胞进行培养,通过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法,检测细胞角蛋白-19（CK 19）、巢蛋白（Nestin）、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培养基中加入纯化的胰岛进行混合培养,通过观察干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。结果  V型胶原酶逆行胰管灌注继而Ficoll 400梯度离心可获得生物活性良好的胰岛;所培养的干细胞表达CK-19、Nestin、胰高血糖素,诱导后部分表达胰岛素。干细胞-胰岛混合培养组及干细胞单独培养组诱导后,细胞胰岛素阳性率分别为38.2%和23.9%,差异有统计学意义(P<0.05);CK-19阳性率分别为89.3%和81.6%,其差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论  胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向β前体细胞的转化率,其作用与CK-19的表达密切相关。     

血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的:观察血小板衍生生长因子-BB对培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞胶原蛋白合成的影响.方法:采用培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞,应用3H-脯氨酸掺入方法,观察血小板衍生生长因子-BB对3种细胞胶原蛋白合成的影响.结果:血小板衍生生长因子-BB可促进处于静止状态的成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成,并呈现出明显的浓度依赖关系,成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成分别在30 ng/ml和40 ng/ml时达到高峰,血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.在30 ng/ml的血小板衍生生长因子-BB作用下,成纤维细胞和平滑肌细胞分别在36 h和48 h时胶原蛋白合成达到高峰.结论:血小板衍生生长因子-BB可明显促进培养的人血管平滑肌细胞和成纤维细胞的胶原蛋白的合成,对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.     

血管平滑肌细胞和内皮细胞联合种植生物可降解材料的组织工程血管研究

目的探讨应用组织工程学方法构建人工血管片。方法应用聚(乙交酯/丙交酯)二元共聚物(PLGA)无纺网织片作为细胞支架,体外逐层顺序种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作组织血管片。免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞、内皮细胞;扫描电镜观察组织血管片生长情况;放射免疫方法检测内皮细胞分泌内皮素、前列腺素E的功能。结果免疫组织化学染色鉴定平滑肌细胞肌动蛋白染色阳性,内皮细胞凝血Ⅷ因子相关抗原染色阳性。组织血管片在扫描电镜下显示出细胞融合,连接成片。放射免疫方法可以检测出平滑肌细胞和内皮细胞联合培养的组织片分泌内皮素(229pg/ml±34pg/ml),分泌前列环素的代谢产物6-酮-前列腺素F1α(402pg/ml±108pg/ml)。结论应用PLGA无纺网织片作为细胞支架,体外逐层种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作的组织血管片,基本具备正常血管组织基本形态结构和功能。     

胎兔动脉导管平滑肌细胞氧敏感性钾通道mRNA的表达

目的:建立胎兔动脉导管平滑肌细胞的体外培养方法,并检测其细胞膜氧敏感性钾通道亚型(Kv1.5)mRNA的表达。方法:采用组织块改良贴壁法(玻片压迫组织块贴壁方法)进行胎兔动脉导管平滑肌细胞的体外原代培养,并行免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定,用RT-PCR的方法检测其细胞膜氧敏感性钾通道亚型(Kv1.5)的表达。结果:经10-14 d培养后,培养皿底及盖玻片上铺满梭状细胞,免疫组织化学法鉴定确认为胎兔动脉导管平滑肌细胞,其细胞膜存在Kv1.5基因表达。结论:植块改良贴壁法可以成功的进行胎兔动脉导管平滑肌细胞的体外培养,且本法简便、可靠,短时间内可以获得大量细胞,从而为动脉导管未闭发病机制的研究奠定了实验基础。同时,动脉导管平滑肌细胞膜上存在氧敏感性钾通道mRNA的表达,从而为从氧敏感性钾通道层面来研究动脉导管未闭的发生机制提供了实验基础。     

A study of endothelium-dependent proliferation of pulmonary smooth muscle cells in vitro

Summary The direct effect of hypoxia and the effect of hypoxic endothelial cells conditioned medium on cultured pulmonary arterial smooth muscle cells in vitro were studied with phase contrast microscopy,³H-thymidine labelled technique and flow cytometric measurements. The results showed that direct hypoxia inhibited proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, retained pulmonary arterial smooth muscle cells in the Go/G₁ phase and decreased³H-thymidine incorporation into pulmonary arterial smooth muscle cells and that hypoxic endothelial cells conditioned medium stimulated proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, promoted pulmonary arterial smooth muscle cells from G₀/G₁ phase to S phase and increased³H-thymidine incorporation into pulmonary arterial smooth muscle cells. It was reasonable to believe that hypoxia might enable pulmonary arterial endothelial cells to secrete some growth factors which could stimulate proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, thereby playing an important role in structural remodeling of the pulmonary arteries and in the development of hypoxic pulmonary hypertension.     

A novel bioreactor to simulate urinary bladder mechanical properties and compliance for bladder functional tissue engineering

Background  Bioreactors are pivotal tools for generating mechanical stimulation in functional tissue engineering study. This study aimed to create a bioreactor that can simulate urinary bladder mechanical properties, and to investigate the effects of a mechanically stimulated culture on urothelial cells and bladder smooth muscle cells.

Methods  We designed a bioreactor to simulate the mechanical properties of bladder. A pressure-record system was used to evaluate the mechanical properties of the bioreactor by measuring the pressure in culture chambers. To test the biocompatibility of the bioreactor, viabilities of urothelial cells and smooth muscle cells cultured in the bioreactor under static and mechanically changed conditions were measured after 7-day culture. To evaluate the effect of mechanical stimulations on the vital cells, urethral cells and smooth muscle cells were cultured in the simulated mechanical conditions. After that, the viability and the distribution pattern of the cells were observed and compared with cells cultured in non-mechanical stimulated condition.

Results  The bioreactor system successfully generated waveforms similar to the intended programmed model while maintaining a cell-seeded elastic membrane between the chambers. There were no differences between viabilities of urothelial cells ((91.90±1.22)% vs. (93.14±1.78)%, P >0.05) and bladder smooth muscle cells ((93.41±1.49)% vs. (92.61±1.34)%, P >0.05). The viability of cells and tissue structure observation after cultured in simulated condition showed that mechanical stimulation was the only factor affected cells in the bioreactor and improved the arrangement of cells on silastic membrane.

Conclusions  This bioreactor can effectively simulate the physiological and mechanical properties of the bladder. Mechanical stimulation is the only factor that affected the viability of cells cultured in the bioreactor. The bioreactor can change the growth behavior of urothelial cells and bladder smooth muscle cells, resulting in the cells undergoing adaptive changes in mechanically-stimulated environment.

     

不同浓度dbcAMP对SH-SY5Y细胞向γ-氨基丁酸能神经元分化潜能的影响

目的：建立具有分化成 γ-氨基丁酸能神经元潜能的神经干细胞模型,为γ-氨基丁酸能神经元退行性疾病的研究提供适宜的研究载体。方法：应用双丁酰环腺苷酸（dbcAMP）诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),分为0 mmol?L-1 dbcAMP组（对照组）和0.3、0.6、1.0及2.0 dbcAMP组,观察诱导后各组SH-SY5Y细胞的形态变化;采用Imge-Pro Plus 5.0软件测量神经元样细胞神经突起长度,计算神经突起>30 μm细胞所占细胞总数的百分率;采用免疫荧光细胞化学技术检测γ-氨基丁酸能神经元标志性蛋白--谷氨酸脱羧酶65(GAD65)的表达,并计算其免疫反应阳性率。结果：形态学观察,对照组SH-SY5Y细胞呈多边形、圆形或梭型,胞膜光滑,边界清晰;各浓度dbcAMP组随着dbcAMP浓度的增加和诱导时间的延长,SH-SY5Y细胞胞体变小、突起变长;1.0 mmol?L-1 dbcAMP组细胞互相交织,表现出成熟神经元的表型。SH-SY5Y细胞诱导培养72 h后,与对照组(31.4%±4.2%)比较,0.3、0.6、1.0和2.0 dbcAMP组神经突起>30 μm细胞所占细胞总数的百分率(40.1%±5.7%、47.5%±6.2%、73.1%±3.2%和74.3%±6.1%）明显升高(P<0.05或P<0.01)。SH-SY5Y细胞诱导培养72 h后,与对照组(10.2%±2.1%)比较,0.3、0.6、1.0和2.0 dbcAMP组GAD65阳性细胞表达率(22.1%±2.4%、46.9%±3.2%、70.7%±3.4%和72.3%±3.7%）明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论:SH-SY5Y细胞具有分化为γ-氨基丁酸能神经元样细胞的潜能,1.0 mmol?L-1是 dbcAMP
的最佳诱导浓度。     

大蒜素对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 观察大蒜素对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法 采用培养的兔血管平滑肌细胞，应用^3H～TdR掺入法，观察在血管紧张素Ⅱ促进VSMC增殖过程中，大蒜素对血管平滑肌细胞DNA合成的影响及其时间效应。结果 血管紧张素Ⅱ可促进处于静止状态的兔血管平滑肌细胞DNA的合成，36h时细胞DNA的合成达到高峰。大蒜素对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用，并呈现出明显的浓度依赖关系，随着大蒜素表度的升高其对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用也逐渐增加，在24h时，10．00g／L的大蒜素对血管平滑肌细胞增殖的抑制率为13．46％。结论 大蒜素可抑制血管紧张素Ⅱ诱导兔血管平滑肌细胞的增殖，并存在一定的量效依赖关系及时间反应性。