采用组织工程技术建造人工膀胱组织的实验研究

目的　通过将扩增的膀胱种子细胞与一定形状聚合材料复合后植入裸鼠体内进行培育 ,尝试采用组织工程技术建造人造膀胱组织的可行性。方法　从幼兔取膀胱 ,机械分离与酶消化获取上皮细胞和平滑肌细胞 ,在体外培养并扩增细胞 ,之后将上皮细胞和平滑肌细胞分别接种到聚合材料的内外表面 ,将其植入到裸鼠体内进行培育。对植入术后4、8周的标本取材 ,进行大体、组织学观察及免疫组化检测。结果　培育的细胞材料复合体的内壁可形成数层移行上皮细胞层 ,外壁由数层平滑肌细胞层构成。随着聚合材料的降解 ,移行上皮细胞与平滑肌细胞不断增殖并达汇合。结论　采用组织工程技术可再造出类似于正常膀胱壁的人造膀胱组织     

抗菌肽LL-37 与膀胱尿路上皮癌关系的初步探讨

目的 检测抗菌肽LL-37 在膀胱尿路上皮癌中的表达,同时体外研究LL-37 对膀胱肿瘤细胞株T24、EJ 的作用。方法 ELISA 检测30 例膀胱尿路上皮癌患者和30 例健康体检者新鲜晨尿中LL-37 的表达,同时检测T24、EJ 细胞和尿路上皮SV-HUC-1 细胞经不同浓度LPS 刺激后细胞培养液上清中LL-37水平。免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测30 例膀胱癌患者的肿瘤组织标本、肿瘤基底及周围组织标本中LL-37 的表达。在体外将不同浓度的LL-37 作用于T24、EJ 和SV-HUC-1 细胞,MTT 检测细胞的增殖。结果 健康体检者和膀胱癌患者尿液中LL-37 的水平分别为（2.02±0.06）和（24.32±0.02）ng/ml,差异有统计学意义（P <0.05）。免疫组织化学结果显示,LL-37 在癌组织中表达阴性,而在癌组织周围的炎症细胞、血管壁及平滑肌内却呈阳性表达。RT-PCR 结果表明,癌周围组织中LL-37的表达水平比癌组织高约30 倍。T24、EJ 和SV-HUC-1 细胞经LPS 刺激后培养液上清中LL-37 浓度均升高。在体外,LL-37 呈剂量依赖性地抑制T24、EJ 细胞的增殖,而其对SV-HUC-1 细胞的抑制需更高的浓度。结论 LL-37 与膀胱癌的发生可能有着一定的关联,体外高浓度的LL-37 可抑制膀胱癌T24、EJ 细胞的生长。     

TGF-β1 inhibits connexin-43 expression in cultured smooth muscle cells of human bladder

Objective： In this research, we studied the TGF-β1 effects on connexin-43 expression in cultured human bladder smooth muscle cells. Methods： Human bladder smooth muscle cells primary cultures, with bladder tissue obtained from patients undergoing cystectomy, were intervened by recombinant human TGF-β1. Connexin-43 expression in human bladder smooth muscle cells was then examined by Western blotting and immunocytochemistry. Results： Stimulation with TGF-β1 led to significant reduction of connexin-43 immunoreactivity and coupling （P〈0.0001）. Connexin-43 protein expression was significantly downregulated （P〈0.05）. Simultaneously, low phosphorylation species of connexin-43 were particularly affected. Conclusion： Our experiments demonstrated a significant downregulation of connexin-43 by TGF-β1 in cultured human bladder smooth muscle cells. These findings support the view that TGF-β1 is involved in the pathophysiology of urinary bladder dysfunction     

不同应力施加方式对膀胱平滑肌细胞影响的比较研究

目的 研究4种不同生物力学应力施加装置对体外培养的膀胱平滑肌细胞生长的影响,设计可行的应力施加装置.方法 本研究设计了4种生物力学装置(圆形压力罐,玻璃水柱管,压力培养瓶,张力罐),将体外培养的膀胱平滑肌细胞分为实验组和对照组,实验组施予40 cmH2O(1 cmH2O=0.0981 kPa)持续性的静水压力(或7...     

生物反应器构建组织工程化血管的初步研究

目的探讨生物反应器内构建具有一定力学强度的组织工程化血管的可行性。方法从6月龄毕格犬的颈总动脉、颈外静脉分别获取平滑肌细胞和内皮细胞，体外培养扩增后，将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸（PGA）上形成细胞-材料复合物，置于生物反应器内（搏动频率75次／min；扩张量〈5％）培养3周，接种内皮细胞继续培养1周后取新生血管，进行大体观察、组织学和免疫组化检测。结果生物反应器内培养的组织工程化血管大体观察具有良好的弹性，管腔圆；平滑肌纤维成分排列规则且有层次感；免疫组化染色显示，平滑肌细胞呈棕黄色层状排列，内皮细胞于血管内侧呈单层排列。结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的组织工程化血管。     

单个结肠平滑肌细胞的制备

目的 :探讨离体肠道平滑肌细胞分离方法。方法 :采用混合酶法分离豚鼠结肠平滑肌细胞 ,通过台盼蓝染色法检查细胞成活率 ,并应用Ca2 + 荧光指示剂Fura 2 AM测定静息状态下结肠平滑肌细胞内游离钙浓度( [Ca2 + ]i)。结果 :成功地分离出单个结肠平滑肌细胞 ,其存活率为 ( 96.7± 2 .6) % ,在静息状态下且细胞外Ca2 + 浓度为 1.5mmol L时 ,豚鼠结肠平滑肌细胞 [Ca2 + ]i 为 ( 10 8± 9.4 )nmol L (n =6) ;细胞外Ca2 + 浓度为 0时 ,[Ca2 + ]i为( 72± 11.8)nmol L (n =6)。结论 :酶法分离的单个结肠平滑肌细胞活性好 ,可应用于肠道平滑肌细胞电生理、药理学研究。     

体外诱导猪骨髓间充质干细胞向尿路上皮细胞分化的实验研究

目的探讨体外诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向膀胱尿路上皮细胞分化的可行性研究,为组织工程膀胱的建立提供一种新的种子细胞来源.方法抽取猪的骨髓液在体外行全血原代培养、扩增及鉴定骨髓间充质干细胞.用机械分离法获取膀胱尿路上皮组织,对其行原代培养、扩增、鉴定并提取尿路上皮细胞培养液.选取第三、四代的BMSCs和尿路上皮细胞分成四组：A组：BMSCs＋尿路上皮细胞＋表皮细胞生长因子;B组：BMSCs＋尿路上皮细胞条件培养液＋表皮细胞生长因子;C组：BMSCs＋表皮细胞生长因子;D组：BMSCs 2 mL.结果用流式细胞仪检测BMSC表面特异阳性标志物CD29、CD44,阴性标志物CD45,结果均为阳性.用角蛋白AE1/AE3单克隆抗体鉴定尿路上皮细胞及实验A、B组结果均为阳性,C、D组均为阴性.结论骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力,模拟体内的微环境可使BMSC向尿路上皮细胞分化.     

益心汤对兔主动脉平滑肌细胞的影响

用临床上治疗冠心病的经验方益心汤观察对培养的兔主动脉平滑肌细胞(简称SMC)增殖的影响。结果用药组 SMC 对倍增长时间为2.17±0.252天,对照组为1.772±0.188天,组间有极显著差异,P<0.001,表明益心汤有抑制培养的兔 SMC 增殖的作用。     

兔脂肪间充质干细胞诱导成膀胱移行上皮细胞的研究

目的 探讨体外诱导兔脂肪间充质干细胞(rabbit adipose tissue-derived stromal cells,rASCs)向膀胱移行上皮细胞分化的可行性.方法 实验分混合共培养组、条件培养液组和空白对照组.混合共培养组是将兔脂肪间充质干细胞rASCs(GFP标记)与兔膀胱移行上皮细胞按1∶1比例混合培养；条件培养液组是将兔膀胱移行上皮细胞上清液与rASCs一起培养;空白对照组是rASCs与普通培养基常规培养.2周后,用免疫荧光法检测诱导分化的脂肪间充质干细胞中膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ和上皮细胞角蛋白CK18的表达.结果 2周后,免疫荧光检测显示,在混合共培养组中,诱导分化的脂肪间充质干细胞表达膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib和上皮细胞角蛋白18、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ没有检测到.而在条件培养液组和空白对照组,上述膀胱移行上皮细胞特异性标记都没有检测到.结论 rASCs与兔膀胱移行上皮细胞混合培养可以诱导rASCs向膀胱移行上皮细胞分化.     

Application of capsaicin on urinary bladder

目的：评价辣椒辣素对急性动物模型中膀胱充盈期和由神经刺激而导致的膀胱收缩期的作用。方法：选用11例成年雄性杂种狗，以袖状电极围绕盆神经做电刺激。刺激参数为10V，20Hz，0．2～2ms方波20s周期。本文作者观察用100μmol／L辣椒辣素前后膀胱在溢出点的压力、容量、顺应性及逼尿肌对盆神经电刺激的反应。同时也做了膀胱组织学检查及P物质测定。结果：辣椒辣素注射诱发了3个狗出现多发性自主膀胱收缩。与对照组比较，膀胱溢出压（39．70士3．22cmH20比48．18士6．33cmH2O）和盆神经刺激所引起的最大膀胱压（17．06土1．49cmH2O比17．47士1．31cmH2O）均无统计学差异。辣椒辣素注射明显增加了膀胱溢出点的容量（82．93土3．51ml比122．22土11．32ml）。结论：在急性动物模型中，辣椒素诱发膀胱容量的改变而非影响其收缩力，膀胱感觉神经的功能改变先于P物质耗竭之前。     

体外培养细胞拉伸加载装置的研制

目的 为模拟在体细胞的应力环境,研制一种对离体细胞施加周期性拉伸应变的实验装置。方法 细胞拉伸加载装置由计算机控制的硬件和软件组成。硬件包括真空负压系统、控制电路和抗干扰优化装置,软件是基于C语言的系统开发套件。此装置利用单片机控制电磁阀和真空泵抽吸柔性细胞培养膜形成负压而使基底膜产生拉伸应变,使贴附生长的细胞受到牵张力的作用。通过对大鼠血管平滑肌细胞的加载实验,进一步验证装置的可行性。结果 加载装置可以对加载力值、牵张及松弛时间和持续工作时间进行有效控制;加载后血管平滑肌细胞在培养板中稳定生长并有增殖活性。结论 本装置满足离体细胞周期性拉伸加载的要求,并可广泛用于拉伸加载条件下的细胞力学生物学的研究。     

早产、足月胎兔动脉导管平滑肌细胞中胱硫醚-γ-裂解酶mRNA表达及意义

目的:研究早产和足月胎兔动脉导管平滑肌细胞胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)mRNA的表达情况。方法:选取日本大耳白胎兔早产组(孕25 d)、足月组(孕30 d)各10只,分离动脉导管平滑肌组织,采用组织块改良贴壁法进行胎兔动脉导管平滑肌细胞的体外培养,半定量逆转录集合酶链(RT-PCR)检测胱硫醚-γ-裂解酶mRNA的表达。结果:经10～15 d培养后,倒置显微镜下观察,动脉导管平滑肌细胞呈梭形或放射状生长,高低起伏形成典型的"峰-谷"样,早产组和足月组CSE mRNA的表达值分别为(29.67±6.7)和(10.35±4.5),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:早产及足月胎兔动脉导管平滑肌细胞均表达CSE mRNA,表达量可能与胎龄有关,提示动脉导管组织可能内源性生成H2S气体,且在宫内低氧环境中H2S可能是维持动脉导管开放状态的一个重要因素。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

内皮素-1受体在兔不全梗阻性膀胱中的研究

目的 :研究内皮素 1受体 (ET 1R)在兔不全梗阻性膀胱中的变化和意义。　方法 :采用受体的放射配基结合分析技术 (RBA) ,对 10只成年雄性新西兰白兔不全梗阻性膀胱 (兔不全梗阻性膀胱模型 ,梗阻 6周为实验组 )及 10只同龄雄性新西兰白兔无梗阻性膀胱术后 6周 (对照组 )的膀胱体及膀胱颈部平滑肌组织ET 1R进行研究。结果 :在膀胱体平滑肌组织中ET 1R结合量 ,实验组较对照组明显增多 (P <0 .0 2 ) ,而膀胱颈平滑肌组织中ET 1R结合量无明显变化 (P >0 .2 )。实验组较对照组的膀胱重量明显增加 (P <0 .0 0 1)。　结论 :兔不全梗阻性膀胱的膀胱体平滑肌组织中ET 1R结合量明显增多。ET 1具有收缩平滑肌和促平滑肌、纤维结缔组织增生 (有丝分裂 )的作用 ,故ET 1R的上调是导致兔不全梗阻性膀胱壁结构改变及功能紊乱的重要因素之一。     

诱导向尿路上皮分化的脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质支架的生物相容性研究

目的 探讨脂肪干细胞向尿路上皮细胞分化的可行性,并将诱导后细胞与膀胱脱细胞基质复合培养,评价细胞与支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化组织提供实验基础。 方法 取6只8周龄雄性新西兰大白兔的腹股沟脂肪组织和膀胱组织,通过胶原酶消化法分离脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),同时通过胰蛋白酶消化的方法获取尿路上皮细胞,流式细胞鉴定后将第3代脂肪干细胞与尿路上皮细胞间接共培养2周,并对分化后细胞进行表型鉴定。随后将分化后细胞种植在膀胱脱细胞基质上,通过扫描电镜、组织学切片观察诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上的生长情况。 结果 脂肪干细胞培养成功并在体外扩增,流式术检测表面抗原CD分子,细胞高表达CD29(99.6%)、CD44(98.2%);低表达CD31(1.9%)及CD45(1.6%)。通过间接共培养诱导分化后,细胞免疫荧光、Western blotting检测到尿路上皮标志物UPIa的表达,而未诱导的脂肪干细胞无表达。扫描电镜提示诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上生长,黏附较好。组织学检查可见膀胱脱细胞基质表面细胞平铺生长。 结论 脂肪干细胞向尿路上皮诱导分化后可作为泌尿系组织工程的种子细胞,可能是尿路上皮细胞之外的又一新选择。膀胱脱细胞基质能支持诱导后的脂肪干细胞良好的生长,该支架可作为载体材料用于泌尿系组织工程的修复与重建。      

组织工程猪膀胱无细胞基质的制备

目的探讨猪膀胱无细胞基质制备的方法及其作为生物支架材料应用于组织工程膀胱构建的可行性。方法分别采用酶消化法和去污剂洗涤法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理并进行HE染色及电镜检查。应用MTT法进行细胞毒性测定。对5只新西兰兔行大部分膀胱切除术后,采用异种膀胱无细胞基质修补,6周后取材观察修复组织再生情况。结果两种方法均能去除膀胱中细胞成分,光镜及电镜观察无细胞成分残留,细胞毒性测定为1级,细胞相容性好。兔膀胱修补后6周支架材料上有移行上皮及肌肉组织生长。结论经脱细胞处理的猪膀胱无细胞基质具有良好的组织相容性,有作为组织工程膀胱支架材料的应用前景。     

组织工程血管培养生物反应器出口端加载阻力的应力刺激形成系统的设计与验证

目的改进组织工程血管（TEBV)培养应力形成系统,增强平滑肌细胞分泌的刺激作用。方法在生物反应器出口外侧加 装阻力气泵,构建新的TEBV体外三维培养体系;通过压力导丝监测生物反应器内不同点压力变化,获得应力-时间变化曲线;按 动态培养中是否添加阻力分成改进组和对照组,并设静态培养组,对动脉平滑肌细胞（VSMC）进行四周的三维培养;终止培养 后采用HE染色、masson染色、α-SMA免疫组化染色及电子显微镜进行组织学检测,并运用软件对管壁成分进行半定量分析。 结果压力监测数据及拟合曲线显示,添加阻力后可明显加大动力源“罗叶泵”每搏的应力刺激;培养结果显示改进组新生组织 中VSMC及胶原纤维密布于管壁全层,细胞分布及密度、胶原纤维含量及排列、α-SMA表达均显著优于对照组及静态组。结论 改进的系统应力刺激作用明显得到增强并可进一步促进VSMC分泌功能。     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的 体外分离培养兔血管平滑肌细胞(VSMC)并观察其生长特征.方法 采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力.结果 原代培养5 d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型"峰-谷"状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似"S"形;细胞生长第3～5 d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化最显著.结论 体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5 d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24 h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料.     

成年鼠骨髓间质细胞在体外培养中分化为平滑肌细胞

目的　探讨小鼠骨髓间质细胞在体外经条件培养基诱导定向分化成平滑肌细胞的可行性 ,为研究血管损伤后新生内膜形成机制奠定基础。方法　采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从骨髓中分离骨髓间质细胞 ,通过补加人血管平滑肌条件培养基诱导骨髓间质细胞分化成平滑肌细胞 ,采用形态学和免疫荧光染色分析分化后的细胞特异性标志物 ,并测定 1μmol/L血管紧张素Ⅱ对细胞胞液钙离子浓度及细胞收缩功能的影响 ,通过加入氯沙坦抑制血管紧张素Ⅱ受体验证血管紧张素Ⅱ特异性激活钙通道引发的细胞收缩。结果　骨髓间质细胞经诱导在体外可传代生长 ,稳定传代 6代后 ,分化的细胞形态呈梭形平滑肌样 ,融合后形成峰谷状排列。表达平滑肌特异性蛋白标志物α 肌动蛋白、肌钙结合蛋白和平滑肌肌球蛋白。分化后的细胞经血管紧张素Ⅱ刺激产生瞬间胞液钙离子转移并偶联细胞收缩反应 ,细胞 [Ca2 + ]i呈现瞬间增高变化 ,[Ca2 + ]i为 2 131nmol/L± 14 0nmol/L ,经用氯沙坦后 [Ca2 + ]i被阻断 ,为 4 0 2nmol/L± 31nmol/L。结论　骨髓间质细胞经体外诱导可分化为有收缩功能的平滑肌细胞 ,可用于平滑肌细胞分化和血管损伤后新生内膜形成起源等研究。     

兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的体外分离培养兔血管平滑肌细胞（VSMC）并观察其生长特征。方法采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力。结果原代培养5d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型＂峰-谷＂状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似＂S＂形;细胞生长第3～5d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24h内划痕宽度变化最显著。结论体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料。