肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。     

人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的： 构建人颗粒溶素（GNLY） 全长编码序列的真核表达载体,转染肿瘤细胞,观察GNLY在细胞内的表达及其对细胞增殖的抑制作用. 方法：用RT-PCR技术获取人GNLY 全长编码序列cDNA,克隆至pGEM-T 载体进行测序,再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY,用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC-7721,检测目的基因mRNA的表达,WST-8法检测细胞增殖活性. 结果：获得人GNLY全长编码序列cDNA ,并成功构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY;转染SMMC-7721细胞后,检测出目的基因mRNA的表达;重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有非常显著性差异（P〈0.01和P〈0.001）,并且随着转染基因浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,2.0μg/ml pcDNA3.1（＋）/GNLY转染组细胞增殖活性下降至0.329. 结论：pcDNA3.1（＋）/GNLY真核表达载体构建成功,GNLY基因转染对SMMC-7721细胞能产生细胞毒性效应,对肝癌细胞具有一定的杀伤作用.     

高血压大鼠SLC7A8基因腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带SLC7A8基因的重组腺病毒载体,为进一步研究SLC7A8基因的功能作准备.方法 含SLC7A8目的 基因编码序列(coding domain sequence,CDS)的互补DNA(complementary DNA,cDNA)的pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再将其连接入重组腺病毒载体.以双酶切和测序鉴定正确后,将pAdxsi-GFP-SLC7A8重组腺病毒载体转染大鼠肾小管上皮细胞(rat renal tubular epithelial cells-52e,NRK-52E),流式细胞仪测定转染效率,反转录聚合酶链反应法检测转染后SLC7A8 mRNA的表达.结果 pAdxsi- GFP-SLC7A8重组腺病毒载体构建成功,流式细胞仪测定重组腺病毒载体转染NRK-52E效率为94.1%,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7A8 mRNA表达.结论 本研究成功构建pAdxsi-GFP-SLC7A8重组腺病毒载体,并成功转染NRK-52E细胞,这为我们进一步探索SLC7A8基因的生物学功能奠定了基础.     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

lefty1基因真核表达载体构建鉴定及转染

目的:构建lefty1基因与pcDNA3.1(+)相融合的真核表达载体,并在lefty1基因的下游加上Flag标签,转染人肾小管上皮细胞株验证重组质粒活性。方法:设计并合成lefty1基因上下游引物,同时加上Flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag和pcDNA3.1(+)分别转染至人肾小管上皮细胞株HK-2,qPCR和Western blot检测lefty1在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以lefty1基因质粒模板扩增得到的片段约1 150bp,双酶切得到目的基因片段,测序的结果显示与lefty1基因序列相同。转染肾小管上皮细胞后,pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag能表达lefty1蛋白。结论:成功构建lefty1基因真核表达载体,为一步研究lefty1基因功能奠定了基础。     

MCP-1真核表达载体的构建和鉴定

目的构建大鼠MCP-1真核表达载体pcDNA3.1（＋）-MCP-1。方法据Genebank中大鼠MCP-1cDNA序列设计并合成特异性引物,提取糖尿病模型大鼠肾脏总RNA,利用PCR技术扩增出MCP-1全编码区基因片段,并将扩增产物TA克隆至pMD-18T载体,然后分别双酶切pMD-18T-MCP-1回收目的片段再克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中。结果PCR扩增得到大鼠成熟MCP-1的cDNA片段大小为500 bp,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCDA3.1（＋）-MCP-1。结论成功构建了大鼠MCP-1真核表达载体,为进一步研究MCP-1的DNA疫苗奠定基础提供了条件。     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

钩端螺旋体Lipl21基因真核质粒构建及在HeLa细胞的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Lipl21基因片段的真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染HeLa细胞,探讨其在体外真核细胞中的表达情况,为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据. 方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增Lipl21基因,纯化回收后克隆入pUCM-T载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,运用脂质体2000将重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21转染入HeLa细胞,免疫组化法观察目的基因的表达. 结果双酶切及测序鉴定证明成功构建LipL21真核表达重组体pcDNA3.1（＋）/LipL21,DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段,读码框架正确,无碱基错配及移码突变.重组质粒pcDNA3.1（＋）/LipL21在体外HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21. 结论成功构建了钩端螺旋体Lipl21基因真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/Lipl21,且能够在体外真核细胞中表达,为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础.     

大鼠Smac基因的克隆及其在心肌细胞H9C2中的表达

目的：克隆大鼠促凋亡基因Smac,构建真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在心肌细胞中表达。方法：应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠肾组织中扩增到大鼠Smac基因的CDs片段,构建含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac并将此重组质粒、空载体pcDNA3.1⁺、pcDNA3.1⁺-EGFP通过脂质体介导转染大鼠心肌细胞H9C2,荧光显微镜、流式细胞术间接检测转染效率,RT-PCR法检测外源基因的表达。结果：经测序目的基因序列与GenBank（NM_001008292）公布的结果一致,所构建的重组质粒pcDNA3.1⁺-rSmac经PCR和酶切鉴定所释放的片段大小与预期结果相符。荧光显微镜和流式细胞术检测,细胞转染有效,转染效率达38.36%。转染重组载体pcDNA3.1⁺-rSmac 48 h后,H9C2细胞Smac的mRNA水平明显升高。其中,对照组Smac/β-actin为1.19,空载体组Smac/β-actin为1.31,二者之间差异无显著性（P>0.05）;转染pcDNA3.1⁺-rSmac组Smac/β-actin为1.67,与对照组比较差异具有显著性（P<0.01）。结论：克隆大鼠Smac基因成功,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在转染后的心肌细胞中表达,为研究Smac基因在心肌细胞凋亡过程中的调控作用奠定基础。     

大鼠FXYD5基因的克隆及重组腺病毒载体的构建

目的：克隆大鼠离子通道相关蛋白（FXYD5）基因全长cDNA，构建携带FXYD5基因的重组腺病毒载体，为进一步研究其在自发性高血压大鼠（SHR）中的功能作准备。方法：采用cDNA末端快速扩增的方法获得全长cDNA，并插入到载体pGEM—T Easy中测序分析。将FXYD5基因cDNA克隆至穿梭载体pAdTrack—CMV中，随后在BJ5183细菌中与骨架载体AdEasy—1同源重组。筛选阳性克隆，酶切、测序鉴定正确后，重组载体磷酸钙．DNA共沉淀法转染AD293细胞，获得携带FXYD5基因的重组腺病毒。结果：大鼠FXYD5基因全长cDNA被成功地克隆；FXYD5重组腺病毒载体被成功地构建。结论：运用细菌内同源重组的方法可以在大肠杆菌中快速高效地构建腺病毒载体；FXYD5重组腺病毒载体的成功构建为探讨FXYD5的生物学功能奠定了基础。     

小鼠pMSV-Slfn5-GFP表达质粒构建及基因结构分析

目的 构建小鼠pMSV-Slfn5-GFP基因重组表达质粒及基因结构分析.方法 提取小鼠肝脏组织中总RNA,反转录为cDNA.PCR扩增小鼠Slfn5编码序列片段,并与pGEM-T Easy载体连接,连接产物转化到大肠埃希菌DH5α中.挑取阳性克隆提取质粒,经限制性内切酶H pα工和Xho Ⅰ双酶切鉴定.酶切鉴定正确的质粒送Macrogen USA测序.测序正确的质粒通过HindⅢ和XhoⅠ与pMSV-GFP连接,并命名为pMSV-Slfn5-GFP.通过UCSC(http://genome.ucsc.Edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构,并通过NCBI确定Sgn5的蛋白结构域.结果 Slfn5全长基因序列克隆到表达载体pMSV-GFP中,酶切鉴定片段大小为2.65 kb.Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性.结论 成功构建了小鼠pMSV-Slfn5-GFP全长基因表达载体.     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

利用植物生物反应器表达药用蛋白FC-IL-1ra

目的：构建植物双元表达载体pMCP0-FC-IL-1ra转化根癌农杆菌GV3101并侵染胡萝卜悬浮细胞,筛选得到的阳性细胞24孔板培养1周后,检测上清中FC-IL-1ra蛋白的表达。方法：用PCR的方法扩增得到含组织型纤溶酶原激活物（tPA）分泌型信号肽的FC-IL-1ra片段,并将其连接至测序载体pGEM-T Easy中,测序正确后将FC-IL-1ra片段酶切连接至植物表达载体pMCP0中,经PCR及酶切验证插入片段的正确性。重组质粒经农杆菌GV3101介导转染胡萝卜悬浮细胞,经潮霉素筛选得到阳性克隆,24孔板培养后取上清检测蛋白表达,dot blotting检测及Western blotting验证分泌蛋白FC-IL-1ra。结果：成功构建了植物双元表达载体pMCP0-FC-IL-1ra,转化胡萝卜悬浮细胞后筛选得到阳性克隆,经dot blotting检测获得6个表达较高的细胞克隆,经Western blotting确认获得能分泌FC-IL-1ra蛋白的胡萝卜悬浮细胞株系,但分泌表达的FC-IL-1ra在IL-1ra中间某一位置有断裂。结论：成功构建了植物双元表达载体pMCP0-FC-IL-1ra,并在植物悬浮细胞体外实现了Fc-IL-1ra融合蛋白的分泌表达,证明了利用植物细胞大规模表达药用蛋白的可行性。     

人骨保护素编码区基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人骨保护素（OPG）编码区基因并构建其真核表达载体。方法以人骨肉瘤细胞系MG63总RNA为模板,采用RT-PCR方法获取OPG编码区基因核苷酸序列,应用定向克隆技术,构建真核表达载体pcDNA3.1-OPG-IRES-EGFP。结果获取的OPG编码区全长核苷酸序列与文献报道的完全一致,经PCR和多酶切鉴定证实构建的表达载体正确。结论获得了人骨保护素（OPG）编码区基因,并成功构建了其真核表达载体。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

MAGE-3基因片段真核表达质粒的构建

目的克隆人MAGE-3基因片段，以构建真核重组表达质粒pcDNA3-1-MAGE-3，为制备以MAGE-3基因片段为基础的核酸疫苗及探讨相关的肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法RT—PCR法从肝癌组织制备出含BamHI、EcoRI酶切位点的MAGE-3基因片段，pGEM-TEasy为克隆载体，pcDNA3，1为真核表达载体，采用DNA重组技术，将目的基因先克隆至pGEM—TEasy载体再亚克隆至pcDNA3．1载体上，然后，据氨苄青酶素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、克隆鉴定引物T7／SP6PCR扩增方法鉴定阳性克隆，并对阳性克隆pcDNA3．1-MAGE-3中的插入序列进行DNA测序。结果扩增出了MAGE-3目的基因片段；经蓝白筛选实验、克隆鉴定引物扩增方法鉴定得到重组子pGEM—T—MAGE-3；引物扩增方法鉴定得到重组子pcD—NA3，1-MAGE-3;DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较，结果完全一致。结论成功构建了重组pcDNA3．1-MAGE-3肿瘤核酸疫苗，为肿瘤免疫治疗提供了条件。     

Cloning of rat beta-defensin rBD-1 cDNA]

This is a study aimed at the molecular mechanisms of beta-defensins gene expression and it's gene transfer experiments for preventing mucosal infection. A rat rBD-1 cDNA was cloned. The total RNA was isolated from rat kidney. The cDNA fragment was amplified by RT-PCR with specific primers. The purified RT-PCR product was cloned in pGEM-T Easy vector. The results of restriction endonuclease pattern analysis of the recombinant plasmid, DNA sequencing, and aligning of the putative amino acid sequence with hBD-1 and mBD-1 demonstrated that rat beta-defensin rBD-1 gene was cloned successfully.     

A型流感病毒株核蛋白基因的克隆与重组质粒的构建

目的克隆A型流感病毒株Swine/Henan/703/2001(H3N2)的核蛋白(NP)基因序列并构建重组质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术从病毒株基因组中扩增出编码核蛋白的基因序列,克隆至pGEM-TEasy载体,经蓝白筛选、菌落PCR及酶切鉴定挑取阳性克隆并测序。结果利用RT-PCR扩增到目的基因片段,并将其克隆至T载体。结论成功构建重组质粒pGEM-TEasy-NP,为NP相关功能及流感疫苗的进一步研究奠定实验基础。