COX-2诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

目的构建环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的诱饵载体,为应用酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)筛选与COX-2相互作用的蛋白建立实验基础。方法 PCR扩增COX-2基因编码区全长,引入酶切位点EcoRⅠ、BamHⅠ,将COX-2基因克隆至载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pGBKT7-COX-2转化到酵母细胞Y190中,检测pGBKT7-COX-2在Mathmaker GAL4Two-Hybrid System3中有无自激活作用。结果 成功扩增了COX-2基因编码区全长,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确,并成功转化到酵母细胞Y190中,检测无自激活作用。结论 成功构建了COX-2的酵母诱饵载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。     

ECT2通过调控EGFR介导的上皮间质转化促进胰腺癌转移

目的研究上皮细胞转化因子2(ECT2)在胰腺癌转移的作用及其可能的诱导表皮生长因子受体(EGFR相关的上皮-间充质转化(EMT)机制。方法使用免疫组织化学和Western blotting方法检测ECT2在胰腺癌组织及细胞系中的表达情况。在胰腺癌细胞中降低ECT2的表达,通过细胞划痕实验测定胰腺癌的细胞迁移变化,使用Transwell实验检测胰腺癌细胞的侵袭力。通过Western blotting方法测定EMT标志物和EGFR的表达变化。结果 ECT2在胰腺癌组织和细胞中显著上调,并提示不良预后。ECT2调控胰腺癌细胞的侵袭和迁移。ECT2沉默下调EGFR表达同时抑制EMT。结论 ECT2可能通过EGFR信号通路相关的EMT促进胰腺癌细胞的侵袭性。     

五聚素3基因甲基化在食管鳞癌中的作用

目的研究食管鳞癌组织中五聚素3(PTX3)基因的表达,以及基因启动子区甲基化状态对其表达的影响。方法应用半定量逆转录PCR(RT-PCR)、甲基化特异性PCR(MSP)、免疫组织化学的方法对癌旁食管黏膜组织和食管鳞癌组织进行检测,分析PTX3基因mRNA的表达、基因启动子区甲基化状态和PTX3蛋白阳性表达与食管癌临床病理特征的关系。结果 25%(5/20)食管鳞癌组织和90%(18/20)正常食管黏膜组织存在PTX3基因表达,PTX3mRNA在食管癌与癌旁组织之间的表达差异有统计学意义(χ2=17.289,P<0.001)。80%(16/20)食管鳞癌组织和25%(5/20)正常食管黏膜组织存在PTX3基因CpG岛超甲基化,提示PTX3基因超甲基化与食管癌发生之间有关联(χ2=12.13,P<0.001)。PTX3蛋白在食管癌组织中表达的阳性率为30.38%(24/79),癌旁食管组织PTX3蛋白阳性表达率为84.81%(67/79)(P<0.001)。随着食管癌临床分期增加,PTX3蛋白阳性表达率逐渐降低。结论 PTX3基因启动子高甲基化是PTX3表达失活的主要原因,在食管鳞癌的发生发展中起重要作用,PTX3基因启动子甲基化可作为食管鳞癌预后评估的潜在肿瘤标志物。     

培哚普利和苯那普利对食管鳞癌荷瘤裸鼠的干预研究

目的 探索血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂(ACEI)在食管鳞癌细胞株中是否存在抑瘤作用.方法 应用RT-PCR法在食管鳞癌细胞株KYSE30、TE-1、EC109、EC9706中筛选出血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达水平最高者,并将其用于接种和建立裸鼠移植瘤模型.成瘤后将裸鼠均分为对照组、培哚普利组、苯那普利组(n=6),分别予0.9％ NaCl溶液、培哚普利(4 mg/kg)、苯那普利(6 mg/kg)干预.测定各组裸鼠移植瘤的体积,计算抑瘤率.免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤瘤体组织内CD31的表达,并计算肿瘤微血管密度(MVD).结果 EC9706细胞株中VEGFmRNA表达水平最高.在第2和第3周时,各组移植瘤体积无明显差异.在第4和第5周时,培哚普利组移植瘤体积与对照组比较无明显差异,抑瘤率分别为24.6％和21.1％,苯那普利组和对照组比较差异均有统计学意义(t=-2.450和-3.120,P=0.035和0.008),抑瘤率分别为33.1％和45.4％.经培哚普利和苯那普利干预后裸鼠移植瘤组织内CD31表达水平有所降低.苯那普利组MVD明显低于对照组(10.98±1.18比13.98±1.76,t=-3.732,P=0.002),培哚普利组(12.41±1.15)则与对照组差异无统计学意义(t=-2.053,P=0.07).结论 苯那普利(6 mg/kg)能明显抑制EC9706裸鼠移植瘤生长,抑制肿瘤新生血管形成可能是其抑瘤机制之一.培哚普利(4 mg/kg)可能存在类似作用.     

内镜超声判断早期胃癌浸润深度的准确性及影响因素研究

目的　研究内镜超声检查术（endoscopic ultrasound,EUS）判断早期胃癌浸润深度的准确性及影响因素。方法　回顾性分析2014年1月—2020年8月于北京友谊医院就诊、行EUS且EUS分期为T1的早期胃癌患者的资料。比较EUS与术后病理浸润深度的一致性,计算EUS判断早期胃癌浸润深度的准确率、灵敏度及特异度,并探究影响EUS准确性的相关因素。单因素及多因素分析均采用Logistic回归模型。结果　共纳入380处病变,EUS发现黏膜内（T1a）病变301处,黏膜下层（T1b）病变79处;术后病理实际浸润深度为T1a病变320处,T1b病变60处。EUS判断早期胃癌浸润深度的准确率为77.1%（293/380）,灵敏度为83.4%（267/320）,特异度为43.3%（26/60）。多因素分析提示,病变位于胃上1/3部（OR=2.272,95%CI：1.266~4.080,P=0.006）、病变长径≥20 mm（OR=2.013,95%CI：1.200~3.377,P=0.008）及低分化癌（OR=2.090,95%CI：1.018~4.294,P=0.045）是影响EUS分期准确性的独立危险因素。低分化癌（OR=4.046,95%CI：1.737~9.425,P=0.001）是EUS过度分期的危险因素。结论　EUS对于早期胃癌浸润深度的判断具有一定的临床应用价值,影响EUS分期准确性的因素包括病变位于胃上1/3部、病变长径≥20 mm及低分化癌,其中低分化癌是EUS过度分期的危险因素。     

肠内营养对DSS诱导的溃疡性结肠炎大鼠肠道通透性的影响

目的研究肠内营养对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜通透性的影响。方法将40只大鼠随机分为4组,正常对照组、模型对照组、甲泼尼龙组、谷氨酰胺组,后3组大鼠自由饮用5%DSS溶液7天,建立溃疡性结肠炎模型,后2组同时分别给予甲泼尼龙及谷氨酰胺干预治疗。收集大鼠24h尿液,采用高效液相色谱分析法研究大鼠肠道通透性的情况。结果 DSS诱导的溃疡性结肠炎大鼠乳果糖尿中排出率显著增高(P0.01),甘露醇尿中排出率下降(P0.01),L/M比值在DSS诱导的溃疡性结肠炎大鼠显著增加(P0.01)。与DSS诱导的溃疡性结肠炎模型组比较,甲泼尼龙组大鼠及谷氨酰胺组大鼠乳果糖尿中排出率下降(P0.01),甘露醇尿中排出率升高(P0.01),L/M比值降低(P0.01);谷氨酰胺组较甲泼尼龙组变化明显,但两组比较无显著差异(P0.05)。结论溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜通透性增加,给予肠内营养可降低结肠黏膜通透性。     

c-Met在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其与临床病理的相关性

目的检测食管鳞状细胞癌组织及配对癌旁组织中c-Met蛋白的表达情况,探讨c-Met的表达与食管鳞状细胞癌患者临床病理特点的相关性。方法收集87对甲醛固定,石蜡包埋的食管鳞状细胞癌及配对的癌旁组织标本,所有病例均经病理证实,同时收集患者的临床资料。采用免疫组化的方法检测组织中c-Met的表达情况。结果 c-Met主要表达于细胞膜,表现为胞膜呈棕黄色染色。87例食管鳞癌组织中有29例(33.3%)呈阳性表达。配对癌旁组织中未见c-Met表达。c-Met的表达与食管鳞状细胞癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床病理分期(tumor-node-metastasis,TNM)存在显著相关性(分别为P=0.017,P=0.000,P=0.000),而与患者的性别、年龄、肿瘤细胞分化程度、肿瘤大小等无明显相关性(P>0.05)。结论 c-Met在部分食管鳞癌组织中呈高表达,且与患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期存在显著相关性,c-Met的高表达可以作为高侵袭性食管鳞癌的分子标志物。     

TIM-3基因启动子区多态性与胃癌易感的相关性研究

目的探讨中国汉族人群中肿瘤免疫调节基因TIM-3启动子区单核苷酸多态性与胃癌的遗传易感性关联。方法提取190例胃癌患者及216例健康人群外周血基因组DNA,用PCR-RFLP方法检测2组人群中TIM-3基因启动子区-574G/T、-882C/T、-1516G/T3个多态性位点的基因型;各多态位点的基因型与胃癌风险之间的相关性以OR值(odds ratio)及其95%CI(confidence intervals)表示;OR值及其95%CI以非条件Logistic回归模型分析,均经各混杂因素校正后取得;所有的统计检验均为双侧概率检验,统计学分析使用SPSS11.5软件。结果 PCR-RFLP检测结果显示,TIM-3启动子区的3个多态性位点在检测人群中均存在,但3个位点的多态纯合形式在研究人群中几乎没有出现。190例胃癌患者与216例健康对照人群中3个多态性位点的基因率差异均有统计学意义(P<0.05)。经混杂因素的校正后,Logistic回归分析结果显示3个位点的基因型差异均有统计学意义,-574G/T位点:OR=3.92(95%CI:1.40-10.94);-882C/T位点:OR=3.20(95%CI:1.22-8.41);-1516G/T位点:OR=2.32(95%CI:1.23-4.40),P值均<0.05。结论 TIM-3启动子区的基因多态性对于胃癌的发生有着显著的易感关联,虽然该3个位点的多态性纯合基因型存在形式极低,但结果依然提示对于胃癌的发生,TIM-3启动子区的多态性仍是一个重要的易感危险因素。     

环氧合酶-2启动子甲基化在食管鳞癌中的作用

目的明确在低表达环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的食管鳞癌细胞中COX-2表达与其启动子甲基化状态之间的关系。探讨对于低表达环氧合酶2的食管鳞癌给予去甲基化联合COX-2选择性抑制剂治疗的意义。方法选择低表达COX-2的食管鳞癌TE-1细胞,RT-PCR法检测mRNA表达,DNA测序的方法检测COX-2启动子的甲基化状态。用5-氮杂脱氧胞苷和尼美舒利干预细胞株,比较干预前后细胞的COX-2启动子甲基化状态的变化及COX-2mRNA表达。用MTT法检测不同干预因素对细胞增生抑制作用的差异。ELISA检测前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)浓度。结果食管鳞癌TE-1细胞的COX-2核酸呈低表达,而其启动子呈高甲基化状态,甲基化率为58.3%。用去甲基化制剂5-氮杂脱氧胞苷干预后,该细胞的COX-2启动子甲基化率降低为30%,同时核酸表达增加,差异有统计学意义。单独用尼美舒利干预细胞的抑制率为16.2%,而联合5-氮杂脱氧胞苷和COX-2选择性抑制剂尼美舒利干预后细胞的增生抑制明显,抑制率升高为48.63%,差异具有统计学意义。去甲基化干预后PGE2浓度从553.96pg/mL升高到647.54pg/mL。结论对于低表达环氧合酶2的食管鳞癌细胞其启动子高甲基化可能是影响其核酸表达的原因,给予去甲基化干预可使环氧合酶2的核酸表达增加,再联合环氧合酶2选择性抑制剂能够抑制食管鳞癌细胞的增生,是一种可能的治疗选择。