逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

单纯疱诊病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢上皮癌细胞杀伤作用的研究

目的：探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1-tk）基因转染,联合抗病毒药物羟甲基无环鸟苷（ganciclovir,GCV）和无环鸟苷（acyclovir,ACV）对人卵巢上皮癌（OEC）细胞系TYK的杀伤作用。方法：用lipofection reagent介导法将PLNTK5质粒转移入包装细胞PA317中,用滴度最高的PA317病毒上清液转染TYK细胞,运用MTT法及光镜、电镜检测GCV、ACV对目的细胞的体外杀伤效应。结果：将PLNTK5质粒转入PA317细胞后,得到了稳定的产病毒细胞株。TYK细胞可被病毒上清液转染,转导HSV1-tk基因可显著增强ACV、GCV对TYK细胞的杀伤作用。结论：逆转录病毒可介导HSV1-tk基因转染TYK细胞并获稳定表达,ACV、GCV对携有HSV1-tk基因的卵巢癌细胞有明显的体外杀伤作用。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢上皮癌细胞杀伤作用的研究

目的:探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)基因转染,联合抗病毒药物羟甲基无环鸟苷(ganciclovir,GCV)和无环鸟苷(acyclovir,ACV)对人卵巢上皮癌(OEC)细胞系TYK的杀伤作用.方法:用lipofectionreagent介导法将PINTK5质粒转移入包装细胞PA317中,用滴度最高的PA317病毒上清液转染TYK细胞,运用MTT法及光镜、电镜检测GCV、ACV对目的细胞的体外杀伤效应.结果:将PLNTK5质粒转入PA317细胞后,得到了稳定的产病毒细胞株.TYK细胞可被病毒上清液转染,转导HSV1-tk基因可显著增强ACV、GCV对TYK细胞的杀伤作用.结论:逆转录病毒可介导HSV1-tk基因转染TYK细胞并获稳定表达,ACV、GCV对携有HSV1-tk基因的卵巢癌细胞有明显的体外杀伤作用.     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肿瘤基因治疗中的应用

胸苷激酶基因在细菌和哺乳动物细胞中都存在，但只有病毒的胸苷激酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶才能使更昔洛伟(ganciclovir，GCV)等核苷类似物磷酸化，磷酸化的核苷类似物干扰DNA的合成而中止细胞的复制，尤其在肿瘤细胞中。在近10年，人们利用HSV—tk基因通过病毒载体转染多种肿瘤细胞，然后给予更昔洛伟(GCV)或阿昔洛伟(acyclovir，ACV)，在体外、体内试验对肿瘤细胞的杀伤作用都很明显。另外HSV—tk／GCV系统在抗肿瘤作用中有“旁观”效应，即转染有HSV-tk基因的靶细胞与未转染的HSV-tk基因的靶细胞同样可被GCV杀伤。由于HSV—tk／GCV系统的抗肿瘤作用效果明显，安全性好，越来越多的肿瘤患志愿接受实验，该系统已获准临床实验。本综述了近10年来HSV-tk／GCV系统在抗肿瘤治疗探索中的应用，大量资料显示HSV—tk基因用于抗肿瘤治疗将是本世纪的重要方法。     

GM-CSF-tk融合基因转导人神经母细胞瘤株SH-SY5Y的抗瘤作用

目的:将单纯疱疹病毒胸苷激酶和粒细胞-单核细胞集落刺激因子融合基因(Lxpsp-hGM-CSF-Hytk)转导人恶性神经母细胞瘤株SH-SY5Y,观察外源融合基因的表达及其对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:FuGENE6介导将含融合基因的逆转录病毒表达载体和仅含潮霉素磷酸转移酶基因的对照载体分别转染逆转录病毒包装细胞系PA317.以适量病毒上清转导SH-SY5Y,RT-PCR方法检测融合基因的存在;细胞因子依赖株TF-1的生长状况及丙氧鸟苷(GCV)杀伤实验鉴定融合基因的表达.结果:将重组病毒产生细胞PA317-GM-CSF-Hytk和PA317-Hy的病毒上清2ml分别转导SH-SY5Y,60 mg·L-1的潮霉素进行筛选,得到了稳定传代的阳性细胞集落SY5Y-GMHytk,SY5Y-Hy.RT-PCR检测阳性细胞集落中有外源的GM-CSF存在.用阳性细胞集落上清培养TF-1细胞,细胞成活.SY5Y,SY5Y-GMHytk,SY5Y-Hy 3种细胞的生长曲线无明显差别,但用不同浓度GCV分别作用于此3种细胞显示:0.03～300 mg·L-1的GCV对SY5Y-GMHytk有明显的杀伤作用(IC50=3 mg·L-1),而对另外两种细胞几乎无毒性作用(IC50＞300 mg·L-1).30 mg·L-1GCV作用96 h后可杀死80%以上的SY5Y-GMHytk细胞.结论:应用逆转录病毒介导,将融合基因GMCSF-tk成功地导入了SH-SY5Y肿瘤细胞株,并观察到外源融合基因的表达及HSV-tk/GCV体系对肿瘤细胞的杀伤作用.     

逆转录病毒介导的HyTK基因转移及杀伤恶性黑色素瘤细胞的…

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因导入恶性肿瘤细胞，随后应用药物丙氧鸟苷可选择性杀死肿瘤细胞。本研究中我们将ＨｙＴＫ基因克隆到逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中，并初除其中的ＳＶ４０早期启动子，构建成重组逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫ／Ｎ，并用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入了肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应研究

目的　研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法　采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细胞 ,建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株PA317 TK ;用该细胞上清液转导人胶质母细胞瘤细胞 ,用不同浓度GCV作用人胶质母细胞瘤细胞SW0 38 C2 TK和野生型SW0 38 C2 ,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测 72h后细胞存活率 ,并求出半杀伤浓度。结果　重组逆转录病毒载体pLXSN TK能有效地将TK基因导入SW0 38-C2细胞内 ,并使其获得对GCV的敏感性 ;体外细胞毒实验 :在 2 0 μmol LGCV存在的情况下 ,野生型细胞无明显改变 ,而实验组细胞明显死亡 ,半杀伤浓度IC50 为 0 8μmol L ,与SW0 38 C2相比 ,对GCV的敏感性提高了 6 0 0倍 ,旁杀效果也较明显。结论　SW0 38 C2转染TK基因后 ,能有效地被GCV杀灭。显示了其潜在的临床应用价值     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨HSV－TK基因介导的GCV系统对人视网膜母细胞瘤（RB）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体pLXSNTK导入包装细胞PA317,筛选出逆转录病毒产生细胞PA317/TK,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染RB细胞,筛选出含TK基因的RB细胞（RB/TK）,用GCV分别处理RB、RB/TK及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人RB裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再经GCV处理。结果：体外实验RB/TK细胞对GCV的敏感性显著高于RB细胞,并存在旁观者效应;RB荷瘤裸鼠内TK/GCV系统对RB细胞的生长也有明显的抑制作用。提示HSVTK/GCV系统有望成为人RB肿瘤的基因治疗途径。     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

HSV-tk基因特异性杀伤大肠癌细胞的实验研究

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－tk)ad基因在大肠癌组织细胞中特异地表达, 以达到靶向基因治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动tk基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡtkＮa,然后以重组逆转录病毒上清染法将重组组织特异性载体及非组织特异性载体分别转导入高分泌ＣＥＡ的大肠癌ＬoＶo细胞中,以Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后给予前药更昔洛韦（ＧＣＶ）进行敏感试验。结果：转导     

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。 方法：构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。 结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高（P<0.001）,细胞周期各期细胞数有所减少（P<0.05）。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,［HRE］hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低（P<0.01）,诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,G₁期和^G0期细胞数有所增高（P<0.05）,S期细胞数减少（P<0.05）。结论：HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。