丙型肝炎病毒IRES基因T载体克隆及序列分析

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）核糖体插入位点（IRES）序列的基因克隆,为以后的亚克隆和抑制肝炎病毒作用的研究提供实验材料。方法以含HCV全长基因的质粒为模板,用PCR技术扩增出HCV的IRES序列,将扩增产物IRES基因插入到PMD18T载体后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析。结果经PCR获得355bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与GeneBank中该基因的序列同源性为99%。结论该实验成功构建了含HCV IRES基因序列的T载体克隆,提示该克隆是用作亚克隆和抑制肝炎病毒研究的理想克隆。     

基于重组PCR法构建人骨保护素N端的酵母表达载体

目的：构建骨保护素（OPG）N端片段的酵母表达载体。方法：OPGN端D1—D4域仅由2个外显子编码。以人基因组DNA为模板．PCR分别扩增外显子2和外显子3，并使外显子2的3’引物和外显子3的5’引物具有相互重叠的一段序列。以2种PCR产物混合物为模板，采用重组PCR扩增OPGN端编码序列，拟插入酵母分泌型表达载体pPIC9K。为使未来分泌表达产物具有完全正确的N末端，再次采用重组PCR策略，将pPIC9K信号肽裂解位点前的一段序列（含单一限制酶位点BamHⅠ）与OPGN端编码序列拼接在一起，从BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ位点插入pPIC9K。结果：得到了OPGN端酵母表达载体，测序证实插入序列正确。结论：重组载体的获得为基因工程研制具有生物活性的OPGN端片段奠定了基础。     

含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒,并在肺腺癌细胞A549中验证其复制能力和溶瘤特性。方法:建立重叠延伸PCR方法,用该方法制备的E1A-IRES片段插入AdEasy载体构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK。并用该病毒与复制缺陷型重组腺病毒rAd-CDglyTK分别感染肿瘤细胞A549,从荧光蛋白表达、细胞病变及病毒增殖等方面进行比较,以确定其复制能力及溶瘤特性。结果:成功构建了含融合自杀基因CDglyTK的复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK,该病毒感染肿瘤细胞A549后报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达,能大量增殖并出现明显的细胞病变效应(CPE)。结论:构建的复制型重组腺病毒在肿瘤细胞内的复制能力、溶瘤特性和外源基因的表达明显优于目前广泛应用的复制缺陷型重组腺病毒。     

pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定

目的：利用基因工程技术构建pmRNA IRES—hKDR（Ig1-3）重组质粒，为其应用于肿瘤的基因治疗奠定基础。方法：以本实验室构建保存的pcDNA3．1hKDR为模板，PCR扩增hKDR（Ig1-3）eDNA片段后用Nco Ⅰ和XhoⅠ酶切后插入pmRNA IRES多克隆位点的相应位点中，经PCR、酶切和测序鉴定其序列正确性，然后用试剂盒体外转录出相应的mRNA，用脂质体转染COS-7细胞，经G418筛选后通过免疫组化和Western blot检测该融合蛋白。结果：PCR、酶切和测序证实pmRNAIRES—hKDR（Ig1-3）构建成功，体外转录出相应的mRNA，免疫组化和Western blot检测出其蛋白表达。结论：成功构建含pmRNAIRES—hKDR（Ig1-3）的真核表达重组质粒，有助于进一步研究其抗肿瘤作用。     

慢性髓性白血病bcr/abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

反义PCDNA3.1(+)/TIMP-1真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒。方法：用Trizol Reagent抽提肝组织中总RNA．采用两对套式引物，以逆转录巢式PCR方法扩增TIMP-1目的片段，双酶切纯化PCR产物及PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒。再将TIMP-1反向插入PCDNA3.1（＋）线性质粒，即构建成反义TIMP-1／PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定。结果：DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论：反义TIMP-1／PCDNA3．1（＋）真核细胞表达质粒构建成功。     

利用套叠PCR技术合成人胰岛素原基因的临床研究

目的设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因。方法以美国国家基因库（GenBank）发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体（pGEX-3x）的特点,经计算机分析、设计人胰岛素原基因为8个寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术体外延伸获得完整的人胰岛素原基因,分子克隆后测定所得基因的核苷酸序列。结果经限制性内切酶分析确定为重组克隆的质粒进行核苷酸序列分析,结果表明,我们所克隆的基因序列完全符合我们先前的设计。结论SOE-PCR技术可用于体外寡核苷酸片段的延伸并获得完整长度的基因。TaqDNA聚合酶延伸反应前以Klenow片段处理可提高较短覆盖末端或较低专一性末端正确延伸的成功率。     

裂解型腺病毒Ad-E1A的构建以及体外对肝癌细胞的作用

目的 构建Ad-E1A裂解型腺病毒载体,研究其对肝癌细胞的裂解作用.方法 以QBI-293A细胞基因组DNA为模板,用特异性引物PCR法扩增E1A基因,酶切后连接到pAdTrack-CMV转移质粒上,用PmeI酶对pAdTrack-CMy-E1A线性化后,与pAdEasy-1共转化在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-E1A;再用PacI酶切对重组腺病毒质粒线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad-E1A腺病毒子.在QBI-293A细胞中多轮感染后获得高效价的病毒.将Ad-EIA腺病毒感染SMMC-7721,并用MTT和流式细胞仪检测Ad-E1A对人肝癌细胞生长和细胞周期的影响.结果 获得高滴度的重组裂解型腺病毒Ad-E1A.Ad-E1A感染SMMC-7721后,出现明显的细胞病变.Ad-E1A对人肝癌细胞SMMC-7721的生长有明显抑制,48 h后效果明显.Ad-E1A可直接诱导SMMC-7721细胞的凋亡.结论 裂解型腺病毒Ad-E1A构建成功并可以显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长,并在肝癌细胞中复制造成细胞裂解,诱导肝癌细胞的凋亡.     

重组携带hIL-10基因的腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带人白细胞介素10(hIL-10)基因的腺病毒载体,体外细胞学鉴定其介导的基因表达.方法 以pORF-hIL10质粒为模板,PCR扩增hIL-10基因,获得hIL10 cDNA片段,酶切并插入线性化pUC19质粒,命名为pUC19-hIL10.再酶切pUC19-hIL10,插入pDC315-EGFP,置换EGFP序列,构建pDC315-hIL10.将质粒pDC315-hIL10和pDC315-EGFP分别共转染至293细胞,产生复制缺陷型重组腺病毒.pDC315-hIL10和pDC315-EGFP分别感染大鼠肝细胞,免疫学方法鉴定目的基因的表达.结果 经PCR扩增、鉴定,证明已正确构建重组腺病毒Ad5-hIL10和Ad5-EGFP.pDC315-EGFP能够在大鼠肝细胞介导EGFP的表达,使细胞呈绿色荧光反应;pDC315-hIL10能够在大鼠肝细胞介导hIL-10的表达.结论 成功构建了重组腺病毒质粒Ad5-hIL10和Ad5-EGFP,可用于IL-10基因对肝细胞损伤的保护作用的进一步研究.     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

异种移植模型转人a1,2岩藻糖基转移酶基因小鼠显微注射DNA片段的制备

目的制备转人琢1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段。方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HTcDNA全长序列,两端含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切纯化质粒鉴定;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-HTcDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HTcDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;PvuⅠ和NotⅠ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液。结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段。结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠。     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

变形链球菌表面蛋白真核表达载体pcDNA3-PAc的构建Ⅲ.变形链球菌表面蛋白PAc编码基因pac的体外扩增

目的 获取完整的变形链球茵表面蛋白PAc的编码基因pac。方法 建立扩增长片段目的基因的PCR反应体系，根据文献报道的pac核苷酸序列设计引物，使用通用缓冲液和高纯度的质粒pPC4l DNA为模板，经PCR扩增pac基因。结果 扩增产物经琼脂糖电泳和分子量鉴定，为单一的4．7kb条带。结论 成功地从质粒pPC4l DNA模板上扩增到全长4．7kb的完整pac基因，为下一步的防龋核酸疫苗的研究提供了物质基础。     

Thienamycin环化酶基因的结构及在大肠杆菌中表达的研究

对来自重组质粒ｐ６ＢＣ１２外源片段上的１．３ｋｂ片段进行核苷酸序列分析，结果表明整个片段的Ｇ＋Ｃ含量为６８．６％，基因结构符合链霉菌基因特点，其上存在一个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ），由４０５个碱基组成，编码１３４个氨基酸，起始密码为ＡＴＧ，终止密码为ＴＧＡ，起始密码上游有保守的ＳＤ序列ＧＧＡＧＧ。推测的－１０区为ＣＡＧＣＣＴ，－３５区为ＴＴＧＣＡＧ。终止密码下游有一个长为１８ｂｐ的反转重复序列。根据基因定位的结果，认为是ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因。它与异青霉素Ｎ合成酶基因连锁。与Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ中异青霉素Ｎ合成酶及克拉维胺酸合成酶相比氨基酸序列的同源性极低，表明这可能是一个新的基因。利用ＰＣＲ技术将环化酶基因扩增并克隆至大肠杆菌高表达载体ｐＴ７－７，使其在大肠杆菌中得到表达，同位素参入实验结果表明蛋白分子量为１４．５ｋＤ，与理论值相符。表达产物在体外可分别将纯化的ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因阻断变株Ｙ３的中间产物和Ｙ３发酵液转化为具抗菌活性物质。     

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。     

DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂（DSB）修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞（HLF）总RNA，逆转录酶-多聚酶链式反应（RT-PCR）扩增hKu70基因cDNA保守序列，经与pGEM-T载体连接，筛选，克隆，抽提质粒和双酶切后，将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中，筛选，克隆，抽提质粒，从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K。结果 经RT-PCR获得467bp含限制性内切酶位点的DNA片段，T载体克隆后经双酶切，测序，确定该片段为hKu70基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，并双酶切，测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为建立该基因低表达细胞株，DNA双链断裂修复缺陷和有关毒理学研究提供工具。